Desarrollo de cilios es vital para la correcta organogénesis. Este protocolo describe un método optimizado para la etiqueta y visualizar las células ciliadas del pez cebra.
En los últimos años, el embrión del pez cebra se ha convertido en un modelo popular para estudiar la biología del desarrollo debido a rasgos como ex útero desarrollo del embrión y la transparencia óptica. En particular, el embrión del pez cebra se ha convertido en un organismo importante para el estudio de la organogénesis de vertebrados del riñón así como desarrollo de las células multiciliated (MCC). Para visualizar el MCC en el riñón de embrión de pez cebra, han desarrollado un protocolo combinado de montaje conjunto fluorescente en situ del hibridación (pescado) y todo Monte inmunofluorescencia (IF) que permite la proyección de imagen de alta resolución. Este manuscrito describe la técnica para localizar Co las transcripciones del RNA y la proteína como una herramienta para entender mejor la regulación de los programas de desarrollo a través de la expresión de diversos factores de linaje.
En las últimas décadas, el pez cebra (Danio rerio) ha surgido como un organismo modelo principal para el estudio de la biología del desarrollo. Los embriones desarrollan fuera de la madre y son ópticamente transparentes. Además, la formación de órganos vitales como el ojo, el riñón y el cerebro anterior se produce rápidamente, con estructuras formadas por sólo 24 h post fertilización (hpf). Lo importante, el genoma del pez cebra se conserva altamente con mamíferos1,2,3. Además, pez cebra y órganos mamíferos tienen similar fisiología y anatomía. El riñón embrionario del pez cebra, o Pronefros, demuestra el valor del sistema modelo de examen de funciones de los genes durante nephrogenesis precoz y determinación del destino de las poblaciones de la célula epitelial conservado de la nefrona vertebrados4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. del mismo modo, el embrión del pez cebra se ha vuelto cada vez más importante en el examen de la ontogenia de MCC11,12,13,14,15, 16 , 17.
Como su nombre lo indica, MCC es las células epiteliales se caracterizan por un haz de cilios móviles ubicados en la superficie apical17. En el pez cebra, MCC funciona en flujo de fluidos y se dispersa en un “canosos” como la moda a lo largo de la mitad de cada Nefrona de los Pronefros 24 hpf11,12,13,14, 15 , 16 , 17. aunque sólo se han observado en un puñado de riñón humano enfermedad casos18,19,20,21, MCC es frecuente en otros tejidos mamíferos tales como el cerebro y tráquea22,23,24, que plantea una serie de retos para el diseño experimental. Estudios elegante en varios modelos vertebrados incluyendo peces cebra han demostrado un camino conservado del destino MCC, con la muesca que se vía de señalización como un inhibidor de la MCC desarrollo12,17,25 ,26,27. Por lo tanto, el Pronefros de pez cebra proporciona un modelo de fácil acceso para estudiar los mecanismos genéticos de MCC desarrollo en vivo11,12,13,14, 15 , 16 , 17.
Transparencia y fácil manipulación genética de embriones de pez cebra han demostrado para ser inestimable rasgos al estudiar las vías genéticas y moleculares que regulan el destino celular, crecimiento y desarrollo del temprano embrión1,2 ,3. Como tales, las técnicas tradicionales a visualizar transcripciones proteína y gen, como hibridación en situ y en caso de montar todo, han sido aplicados a y optimizado para el pez cebra16,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,37,38. Mediante la combinación de protocolos populares de pescado y si, es posible etiquetar y analizar MCC en vivo16,28,37,38.
El protocolo detallado arriba está optimizado para el etiquetado de MCC en el Pronefros con transcripciones de odf3b y α-tubulina en embriones de pez cebra de 24 hpf. Para obtener los mejores resultados se recomienda utilizar embriones recién arreglados y preparados. Embriones que han sido fijados y almacenados en MeOH o Hyb + a-20 ° C por más de una semana se pueden utilizar, pero la probabilidad de fondo no deseados manchas aumenta con el tiempo que los embriones se mantienen en el almacenamiento.
Modificaciones y la resolución de problemas de esta técnica están necesarios adaptar este método para otras suites de marcadores particulares, por ejemplo otros riboprobes antisentido y otros anticuerpos. Muchos métodos para ajustar los parámetros de pasos en el proceso de montaje todo en situ hibridación han sido documentado previamente por nuestro grupo y otros31,34,36,38, 39. Asimismo, cada anticuerpo proteína requerirá algunos problemas en cuanto a tiempos de tinción y rangos aproximados de diluciones y tiempos de incubación para cada anticuerpo primario se estiman mejor mediante la evaluación de resultados documentados28, 35. embriones menores de 24 hpf, tratamiento pK debe ser menor que 2 min, donde embriones mayores de 24 hpf debe tratarse con pK por mas de 2 minutos. También, los embriones mayores de 24 hpf debe ser blanqueada de pigmento antes del tratamiento de pK.
Después de la tinción con la solución de tinción fluorescente, es fundamental para quitar cualquier mancha, anticuerpo y peroxidasas restantes mediante la realización de la serie de lavados de metanol y agua oxigenada. Los lavados de PBS inmediatamente después son vitales para eliminar el metanol sobrante de los embriones. Lo importante, antes de proceder con los anticuerpos IF, hemos encontrado que la acetona y agua desionizada lavados hacen los embriones menos propensos a adherirse a uno con el otro o los tubos de la centrífuga. En nuestra experiencia, anticuerpos para factores de transcripción específicos y otros genes, aunque puede trabajar eficientemente Western blots, no funcionan bien pues si en el pez cebra. Sin embargo, altamente conservadas y abundantes proteínas, como la α-tubulina y β-catenina, funcionan bien en el pez cebra para IF16,37.
Con peces, es posible visualizar las transcripciones del RNA de los genes que aún no tienen anticuerpos específicos en el pez cebra. Mediante la combinación de pescado con IF, según lo demostrado por este protocolo, co-localización de las transcripciones del RNA y la proteína puede ser visto en vivo (figura 2). La naturaleza flexible del protocolo permite la rápida solución de problemas para la visualización de distintos transcritos de RNA y proteínas en numerosos tejidos y puntos del tiempo. Cuando se combina con los rasgos ya respetados de embriones de pez cebra, este protocolo de pescado + si proporciona otra herramienta para explorar la expresión de genes y proteínas importantes a la regulación de la vía del desarrollo.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado en parte por la beca R01DK100237 R.A.W. y el nacional ciencia Fundación postgrado investigación beca no. DGE-1313583 a A.N.M. También agradecemos a la Universidad de ciencia verano pregrado investigación programa de becas para apoyo a M.U. Nos gustaría agradecer el centro para la investigación de pez cebra en la Universidad de Notre Dame para su cuidado dedicado de nuestro pez cebra. También nos gustaría dar las gracias al Departamento de ciencias biológicas así como los miembros de nuestro laboratorio por todo su apoyo y valiosa información.
non-specific protease mixture solution | Roche | 11459643001, pronase from Streptomyces griseus | Dilute in E3 without methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20°C |
E3 solution | Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination | ||
tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Fluka | A5040-250G | To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL |
embryo dishes | VWR | 351029 | |
5 mL glass vials | Wheaton | 225012 | |
disposable plastic Pasteur pippettes | VWR | 414004-004 | |
4% paraformaldehyde (PFA) solution | Electron Microscopy Services | 19210 | Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20°C. Do not refreeze once thawed for use. |
10X PBS | American Bioanalytical | AB11072 | Dilute in distilled water to make a 1X stock |
Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water. |
1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST) | Sigma | P9416 | 0.1% Tween-20 in 1X PBS |
methanol (MeOH) | Sigma | 34860-4L | |
proteinase K | Roche | 3115879001 | Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20°C |
flat bottom microcentrifuge tubes | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
formamide | American Bioanalytical | AB00600 | store at -20°C |
hybridization solution (HYB+) | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 μg/μL heparin; store at -20°C | ||
hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10Q | |
20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution | American Bioanalytical | AB13156 | dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks |
blocking reagent solution | Roche | 11096176001 | dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4°C |
maleic acid buffer solution | Sigma | M0375 and S7653 | 150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5) |
anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | store at 4°C |
Cy3 fluorescent staining solution | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system | store at 4°C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer |
Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma | H1009-500mL | store at 4°C |
molecular grade distilled water (ddH2O) | Mediatech | 25-055-CM | |
acetone | American Bioanalytical | AB00636-01000 | store an aliquot at -20°C |
DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438-034 | aliquot and store at -20°C |
monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1 | Sigma-Aldrich | T6793 | aliquot and store at -20°C |
anti-γ-tubulin anitbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | T5192 | aliquot and store at -20°C |
odf3b cDNA clone MGC:63985 | OpenBiosystems | IMAGE:6792478 | store bacterial glycerol stock at -80°C |
NaCL | American Bioanalytical | AB01915-05000 | |
Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | store at 4°C; protect from light |
Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11029 | store at 4°C; protect from light |
DAPI | Life Technologies | D1306 | aliquot and store at -20°C |
glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | |
glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
mounting media | Polysciences, Inc. | 18606, Aqua-Poly/Mount | store at 4°C |
confocal microscope and associated software | We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software | ||
rocker | Bio-Rad | 1660710EDU |