Cilia ontwikkeling is essentieel voor goede organogenese. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde methode om te etiketteren en ciliated cellen van de zebravis visualiseren.
In de afgelopen jaren heeft de zebravis embryo ontpopt als een populair model te bestuderen van de ontwikkelingsbiologie als gevolg van eigenschappen zoals ex utero embryo-ontwikkeling en optische transparantie. In het bijzonder de zebravis embryo is uitgegroeid tot een belangrijke organisme te bestuderen gewervelde nier organogenese, alsmede multiciliated cel (MCC) ontwikkeling. Om te visualiseren MCCs in de embryonale zebrafish nier, wij hebben ontwikkeld, een gecombineerde protocol van geheel-mount fluorescente in situ -hybridisatie (FISH) en hele monteren immunofluorescentie (IF) waarmee de hoge resolutie beeldvorming. Dit manuscript beschrijft onze techniek voor samen het lokaliseren van afschriften van RNA en eiwitten als een instrument om de regulering van de ontwikkelings programma’s via de uitdrukking van verschillende afkomst factoren beter te begrijpen.
In de afgelopen decennia, heeft de zebravissen (Danio rerio) ontpopt als een eersteklas modelorganisme te bestuderen van de ontwikkelingsbiologie. De embryo’s ontwikkelen buiten de moeder en optisch transparant zijn. Ook de vorming van vitale organen zoals de ogen, nieren en reukkolf treedt snel op met structuren gevormd door gewoon 24u plaatsen bevruchting (hpf). De zebravis genoom is bovenal zeer geconserveerd met zoogdieren1,2,3. Daarnaast, hebben zebravis en zoogdieren organen soortgelijke anatomie en fysiologie. De zebravis embryonale nier-, of pronephros, toont de waarde van de modelsysteem voor de behandeling van de genfunctie tijdens de vroege nephrogenesis en bepaling van het lot van geconserveerde epitheliale cel populaties van de gewervelde Nefron4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. ook geworden de zebravis embryo steeds belangrijker bij de behandeling van de ontogenie MCCs11,12,13,14,15, 16 , 17.
Zoals hun naam al doet vermoeden, zijn MCCs epitheliale cellen gekenmerkt door een bundel van motile cilia gelegen aan de apicale oppervlakte17. In de zebravis, MCCs functioneren in vloeistofstromen en zijn gedispergeerd in een “peper” zoals wijze over het gehele van het midden van elke Nefron van de pronephros door 24 hpf11,12,13,14, 15 , 16 , 17. Hoewel ze hebben slechts opgemerkt in een handvol van menselijke nier ziekte gevallen18,19,20,21, MCCs heersen in andere zoogdieren weefsels zoals de hersenen en luchtpijp22,23,24, die een groot aantal uitdagingen voor experimenteel design vormt. Elegante studies in verschillende gewervelde modellen, met inbegrip van de zebravis hebben aangetoond dat een geconserveerde traject van MCC lot, met de inkeping signalering traject als een inhibitor van de omwenteling van MCC ontwikkeling12,17,25 ,26,27. Dus, de zebravis pronephros biedt een gemakkelijk toegankelijk model voor het bestuderen van de genetische mechanismen van MCC ontwikkeling in vivo11,12,13,14, 15 , 16 , 17.
Zowel de transparantie en de gemakkelijke genetische manipulatie van zebravis embryo’s hebben bewezen te zijn van onschatbare kenmerken bij de studie van de genetische en moleculaire trajecten die lot van de cel, weefsel groei en ontwikkeling van de vroege embryo1,2 regelen ,3. Als dergelijke, traditionele technieken te visualiseren van eiwitten en gene afschriften, zoals in situ hybridisatie en hele mount als, zijn toegepast op en geoptimaliseerd voor de zebravis16,28,29, 30,31,32,33,34,35,,36,,37,38. Door het combineren van populaire protocollen voor vis en als, is het mogelijk label te analyseren MCCs in vivo16,28,37,38.
Het protocol hierboven is geoptimaliseerd voor het labelen van MCCs in de pronephros met odf3b transcripties en α-tubuline in 24 hpf zebrafish embryo’s. Voor de beste resultaten, is het aanbevolen om het gebruik van vers vaste en bereid embryo’s. Embryo’s die zijn vastgesteld en in MeOH of Hyb + opgeslagen bij-20 ° C gedurende langer dan één week kunnen worden gebruikt, maar de kans op ongewenste achtergrond kleuring neemt toe met de tijd dat de embryo’s worden bewaard in opslag.
Wijzigingen en het oplossen van deze techniek zijn noodzakelijk voor het afstemmen van deze methode voor andere suites van bepaald merkers, bijvoorbeeld andere antisense riboprobes en andere antistoffen. Veel methoden voor het aanpassen van de parameters van de stappen in het proces van hele berg in situ hybridisatie geweest eerder gedocumenteerd door onze fractie en anderen31,34,36,,38, 39. Ook elk eiwit antilichaam vergt een aantal controles op het gebied van de kleuring van tijden en geschatte reeksen van verdunningen en incubatie tijden voor elke primair antilichaam worden best geschat door evaluatie van gedocumenteerde resultaten28, 35. voor embryo’s jonger dan 24 hpf, pK behandeling moet korter zijn dan 2 min, waar embryo’s ouder dan 24 hpf pK langer dan 2 min moet worden behandeld. Ook embryo’s ouder dan 24 hpf van pigment vóór de pK behandeling moet worden gebleekt.
Na kleuring met de fluorescerende kleurstofoplossing, is het van cruciaal belang voor het verwijderen van alle resterende vlek, antilichaam en Peroxidasen door het uitvoeren van de reeks van methanol en waterstofperoxide wast. De PBS wast onmiddellijk na zijn essentieel voor het verwijderen van overtollige methanol uit de embryo’s. Nog belangrijker is, voordat u verdergaat met de IF-antistoffen, hebben we vonden de aceton en gedeïoniseerd water wast dat de embryo’s minder kans zich te houden aan elkaar en/of de centrifuge buizen. In onze ervaring, antilichamen voor specifieke transcriptiefactoren en andere genen, hoewel zij efficiënt kunnen werken westelijke vlekken, werken niet goed voor als in de zebravis. Echter werken zeer geconserveerde en overvloedige eiwitten, zoals α-tubuline en β-catenine, goed in de zebravis voor als16,37.
Met vis is het mogelijk om te visualiseren van RNA transcripties van genen die nog geen specifieke antistoffen in de zebravis. Door het combineren van vissen met als, zoals blijkt uit dit protocol, kan co lokalisatie van afschriften van RNA en eiwit worden gezien in vivo (Figuur 2). De flexibele aard van het protocol kan snelle oplossing voor de visualisatie van verschillende afschriften van RNA en eiwitten in vele weefsels en tijd punten. Wanneer gecombineerd met de al gerespecteerde trekken van zebravis embryo’s, biedt dit protocol van vis + als een ander hulpmiddel voor het verkennen van de expressie van genen en eiwitten belangrijk bij verordening van de ontwikkelingsdoelen traject.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de toekenning van R01DK100237 aan R.A.W. en de National Science Foundation Graduate onderzoek Fellowship nr. DGE-1313583 naar A.N.M. Wij danken ook de College van wetenschap zomer Undergraduate Research Fellowship-programma voor steun aan M.U. We bedank het centrum voor Zebrafish onderzoek aan de Universiteit van Notre Dame voor hun specifieke verzorging van onze zebrafish. Wij zouden ook willen bedanken de afdeling biologische wetenschappen, alsmede de leden van ons lab voor al hun steun en waardevolle inzichten.
non-specific protease mixture solution | Roche | 11459643001, pronase from Streptomyces griseus | Dilute in E3 without methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20°C |
E3 solution | Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination | ||
tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Fluka | A5040-250G | To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL |
embryo dishes | VWR | 351029 | |
5 mL glass vials | Wheaton | 225012 | |
disposable plastic Pasteur pippettes | VWR | 414004-004 | |
4% paraformaldehyde (PFA) solution | Electron Microscopy Services | 19210 | Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20°C. Do not refreeze once thawed for use. |
10X PBS | American Bioanalytical | AB11072 | Dilute in distilled water to make a 1X stock |
Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water. |
1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST) | Sigma | P9416 | 0.1% Tween-20 in 1X PBS |
methanol (MeOH) | Sigma | 34860-4L | |
proteinase K | Roche | 3115879001 | Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20°C |
flat bottom microcentrifuge tubes | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
formamide | American Bioanalytical | AB00600 | store at -20°C |
hybridization solution (HYB+) | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 μg/μL heparin; store at -20°C | ||
hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10Q | |
20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution | American Bioanalytical | AB13156 | dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks |
blocking reagent solution | Roche | 11096176001 | dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4°C |
maleic acid buffer solution | Sigma | M0375 and S7653 | 150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5) |
anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | store at 4°C |
Cy3 fluorescent staining solution | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system | store at 4°C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer |
Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma | H1009-500mL | store at 4°C |
molecular grade distilled water (ddH2O) | Mediatech | 25-055-CM | |
acetone | American Bioanalytical | AB00636-01000 | store an aliquot at -20°C |
DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438-034 | aliquot and store at -20°C |
monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1 | Sigma-Aldrich | T6793 | aliquot and store at -20°C |
anti-γ-tubulin anitbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | T5192 | aliquot and store at -20°C |
odf3b cDNA clone MGC:63985 | OpenBiosystems | IMAGE:6792478 | store bacterial glycerol stock at -80°C |
NaCL | American Bioanalytical | AB01915-05000 | |
Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | store at 4°C; protect from light |
Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11029 | store at 4°C; protect from light |
DAPI | Life Technologies | D1306 | aliquot and store at -20°C |
glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | |
glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
mounting media | Polysciences, Inc. | 18606, Aqua-Poly/Mount | store at 4°C |
confocal microscope and associated software | We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software | ||
rocker | Bio-Rad | 1660710EDU |