Développement de cils est vitale pour l’organogenèse appropriée. Ce protocole décrit une méthode optimisée pour étiqueter et de visualiser les cellules ciliées du poisson-zèbre.
Ces dernières années, l’embryon de poisson zèbre est devenue un modèle populaire pour étudier la biologie du développement en raison de caractéristiques telles que l’ex utero le développement de l’embryon et de la transparence optique. En particulier, l’embryon de poisson zèbre est devenu un organisme important d’étudier l’organogenèse rein vertébrés ainsi que le développement de cellules multiciliées (MCC). Pour visualiser les tableaux dans le rein de l’embryon de poisson zèbre, nous avons développé un protocole combiné de l’ensemble-mount fluorescent in situ hybridation (poisson) et monter ensemble immunofluorescence (IF) qui permet l’imagerie haute résolution. Ce manuscrit décrit notre technique pour localiser conjointement les transcriptions d’ARN et de protéine comme un outil pour mieux comprendre la réglementation des programmes de développement par le biais de l’expression des divers facteurs de la lignée.
Depuis les dernières décennies, le poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un organisme modèle privilégié pour étudier la biologie du développement. Les embryons se développent en dehors de la mère et sont optiquement transparents. En outre, la formation des organes vitaux tels que le œil, des reins et du cerveau se produit rapidement, avec des structures formées par seulement 24 heures après la fécondation (hpf). Ce qui est important, le génome du poisson-zèbre est très conservé avec mammifères1,2,3. En outre, poisson-zèbre et organes de mammifères ont similaires l’anatomie et la physiologie. Le poisson-zèbre rein embryonnaire ou pronéphros, démontre la valeur du système modèle pour étudier la fonction du gène pendant néphrogénèse précoce et de la détermination du sort des populations de cellules épithéliales conservée du néphron vertébrés4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. de même, l’embryon de poisson zèbre est devenu de plus en plus important dans l’examen de l’ontogénie du MCCs11,12,13,14,15, 16 , 17.
Comme leur nom l’indique, le CCM est des cellules épithéliales, caractérisés par un faisceau de cils mobiles situées sur la surface apicale17. Dans le poisson-zèbre, MCCs fonctionnent dans les écoulements de fluides et sont dispersées dans un « poivre » comme la mode dans le milieu de chaque néphron du pronéphros par 24 hpf11,12,13,14, 15 , 16 , 17. bien qu’ils n’ont été notés dans une poignée de rein humain maladie cas18,19,20,21, CCM est fréquents dans les autres tissus comme le cerveau des mammifères et trachée22,23,24, qui pose une multitude de défis pour la conception expérimentale. Des études élégants dans divers modèles vertébrés, y compris le poisson-zèbre ont démontré une voie conservée du destin MCC, avec l’encoche voie de signalisation comme inhibiteur de la MCC développement12,17,25 ,26,27. Par conséquent, le poisson-zèbre pronéphros fournit un modèle facilement accessible afin d’étudier les mécanismes génétiques de MCC development in vivo11,12,13,14, 15 , 16 , 17.
Transparence tant facile manipulation génétique des embryons de poissons zèbres se sont avérés pour être des traits précieux lorsque l’on étudie les voies génétiques et moléculaires qui régulent le sort de la cellule, la croissance des tissus et le développement de l’ embryon précoce1,2 ,3. Comme telles, techniques traditionnelles pour visualiser les transcriptions de protéines et de gènes, tels que l’hybridation in situ et toute monture si, ont été appliqués aux et optimisé pour le poisson-zèbre16,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,37,38. En combinant les protocoles populaires pour les poissons et si, il est possible d’étiqueter et d’analyser les CCM en vivo28,16,37,38.
Le protocole décrit ci-dessus est optimisé pour marquage CCM dans le pronéphros avec transcriptions odf3b et α-tubuline dans des embryons de poisson-zèbre 24 hpf. Pour de meilleurs résultats, il est recommandé d’utiliser des embryons fraîchement fixes et préparés. Les embryons qui ont été fixés et stockés dans MeOH ou Hyb + à-20 ° C pendant plus d’une semaine peuvent être utilisés, mais la probabilité de fond indésirables augmente avec le temps que les embryons sont conservés dans le stockage de coloration.
Modifications et dépannage de cette technique sont nécessaires pour adapter cette méthode pour les autres suites de marqueurs particulières, par exemple les autres anticorps et autres cavitation antisense. Plusieurs méthodes permettant d’ajuster les paramètres des étapes du processus d’hybridation, support entier in situ ont été documentés précédemment par notre groupe et d’autres31,34,36,38, 39. De même, chaque protéine anticorps nécessitera quelques dépannage en termes de temps de coloration et gammes approximatives de dilutions et temps d’incubation pour chaque anticorps primaire sont mieux estimés par évaluation des résultats documentés28, 35. pour les embryons âgés de moins de 24 hpf, pK traitement devrait être inférieur à 2 min, où des embryons plus vieux que 24 hpf devrait être traitées avec pK pendant plus de 2 min. En outre, des embryons plus vieux que 24 hpf devrait être blanchi de pigment avant traitement pK.
Après coloration avec la solution de coloration fluorescente, il est essentiel d’enlever toute tache, anticorps et peroxydases restants en accomplissant la série de lavages de méthanol et d’eau oxygénée. Les lavages de PBS immédiatement après sont vitales pour enlever l’excès de méthanol des embryons. Ce qui est important, avant de poursuivre avec les anticorps de l’IF, nous avons trouvé que l’acétone et eau déionisée lavages faire les embryons moins susceptibles d’adhérer à un autre et/ou les tubes à centrifuger. Dans notre expérience, les anticorps pour les facteurs de transcription spécifiques et d’autres gènes, bien qu’ils peuvent travailler efficacement taches occidentales, ne fonctionnent pas bien, car si dans le poisson-zèbre. Toutefois, des protéines hautement conservées et abondantes, comme la tubuline α et β-caténine, fonctionnent bien dans le poisson-zèbre pour IF16,37.
Avec du poisson, il est possible de visualiser des ARN transcrits des gènes qui n’ont pas encore d’anticorps spécifiques dans le poisson-zèbre. En combinant les poissons avec IF, comme en témoigne le présent protocole, co-localisation des transcriptions d’ARN et de protéine peut être vu en vivo (Figure 2). La souplesse du protocole permet un dépannage rapide pour la visualisation de diverses transcriptions d’ARN et de protéines dans de nombreux tissus et points dans le temps. Lorsqu’il est combiné avec les traits déjà respectés des embryons de poisson-zèbre, ce protocole de poisson + si fournit un autre outil pour étudier l’expression des gènes et des protéines importantes du règlement de la voie du développement.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu en partie par la subvention R01DK100237 à RAW et la National Science Foundation Graduate Research Fellowship no DGE-1313583 à A.N.M. Nous remercions également le Collège de Science Summer Undergraduate Research Fellowship Program pour soutien à M.U. Nous tenons à remercier le Centre pour la recherche de poisson-zèbre à l’Université de Notre Dame pour leurs soins dévoués de notre poisson-zèbre. Nous tenons également à remercier le département des Sciences biologiques ainsi que les membres de notre laboratoire pour l’ensemble de leur soutien et leur compréhension valable.
non-specific protease mixture solution | Roche | 11459643001, pronase from Streptomyces griseus | Dilute in E3 without methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20°C |
E3 solution | Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination | ||
tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Fluka | A5040-250G | To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL |
embryo dishes | VWR | 351029 | |
5 mL glass vials | Wheaton | 225012 | |
disposable plastic Pasteur pippettes | VWR | 414004-004 | |
4% paraformaldehyde (PFA) solution | Electron Microscopy Services | 19210 | Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20°C. Do not refreeze once thawed for use. |
10X PBS | American Bioanalytical | AB11072 | Dilute in distilled water to make a 1X stock |
Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water. |
1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST) | Sigma | P9416 | 0.1% Tween-20 in 1X PBS |
methanol (MeOH) | Sigma | 34860-4L | |
proteinase K | Roche | 3115879001 | Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20°C |
flat bottom microcentrifuge tubes | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
formamide | American Bioanalytical | AB00600 | store at -20°C |
hybridization solution (HYB+) | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 μg/μL heparin; store at -20°C | ||
hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10Q | |
20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution | American Bioanalytical | AB13156 | dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks |
blocking reagent solution | Roche | 11096176001 | dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4°C |
maleic acid buffer solution | Sigma | M0375 and S7653 | 150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5) |
anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | store at 4°C |
Cy3 fluorescent staining solution | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system | store at 4°C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer |
Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma | H1009-500mL | store at 4°C |
molecular grade distilled water (ddH2O) | Mediatech | 25-055-CM | |
acetone | American Bioanalytical | AB00636-01000 | store an aliquot at -20°C |
DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438-034 | aliquot and store at -20°C |
monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1 | Sigma-Aldrich | T6793 | aliquot and store at -20°C |
anti-γ-tubulin anitbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | T5192 | aliquot and store at -20°C |
odf3b cDNA clone MGC:63985 | OpenBiosystems | IMAGE:6792478 | store bacterial glycerol stock at -80°C |
NaCL | American Bioanalytical | AB01915-05000 | |
Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | store at 4°C; protect from light |
Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11029 | store at 4°C; protect from light |
DAPI | Life Technologies | D1306 | aliquot and store at -20°C |
glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | |
glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
mounting media | Polysciences, Inc. | 18606, Aqua-Poly/Mount | store at 4°C |
confocal microscope and associated software | We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software | ||
rocker | Bio-Rad | 1660710EDU |