Desenvolvimento de cílios é vital para a organogênese adequada. Este protocolo descreve um método otimizado para rotular e Visualizar células ciliadas do zebrafish.
Nos últimos anos, o embrião de zebrafish tem emergido como um modelo popular para estudar a biologia do desenvolvimento, devido a características como ex utero desenvolvimento do embrião e transparência óptica. Em particular, o embrião de zebrafish tornou-se um organismo importante estudar organogênese de vertebrados nos rins, bem como desenvolvimento de célula multiciliated (MCC). Para visualizar as MCCs no rim embrionário zebrafish, temos desenvolvido um protocolo combinado de hibridação toda montagem fluorescente em situ (FISH) e montar toda a imunofluorescência (IF) que permite a geração de imagens de alta resolução. Este manuscrito descreve nossa técnica para localização de transcritos de RNA e proteína co como uma ferramenta para entender melhor o Regulamento dos programas de desenvolvimento através da expressão de vários fatores de linhagem.
Ao longo das últimas décadas, o peixe-zebra (Danio rerio) tem emergido como um organismo modelo principal para estudar a biologia do desenvolvimento. Os embriões desenvolvem-se fora da mãe e são opticamente transparentes. Além disso, ocorre a formação de órgãos vitais como o olho, rim e cérebro anterior rapidamente, com estruturas formadas por apenas 24h pós fertilização (hpf). Importante, o genoma de zebrafish é altamente conservado com mamíferos1,2,3. Além disso, o zebrafish e órgãos de mamíferos têm anatomia e fisiologia similares. O zebrafish rim embrionário, ou pronephros, demonstra o valor do sistema modelo para examinar a função dos genes durante a nephrogenesis precoce e determinação do destino das populações de células epiteliais conservada do néfron vertebrados4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. da mesma forma, o embrião de zebrafish tornou-se cada vez mais importante ao analisar a ontogenia dos MCCs11,12,13,14,15, 16 , 17.
Como seu nome sugere, MCCs são células epiteliais, caracterizadas por um conjunto de cílios motile localizado sobre a superfície apical17. No zebrafish, MCCs funcionam no fluxo de fluido em são dispersos em um “sal e pimenta” como a moda em todo o meio de cada néfron do pronephros por 24 hpf11,12,13,14, 15 , 16 , 17. embora eles só foram anotados em um punhado de rim humano doença casos,18,19,20,21, MCCs são predominantes em outros tecidos de mamíferos como o cérebro e traqueia22,23,24, que apresenta uma série de desafios para o projeto experimental. Estudos elegantes em vários modelos de vertebrados, incluindo o zebrafish demonstraram uma via conservada do destino do MCC, com o entalhe de sinalização via como inibidor da MCC desenvolvimento12,17,25 ,26,,27. Portanto, o zebrafish pronephros fornece um modelo facilmente acessível para estudar os mecanismos genéticos de MCC desenvolvimento na vivo11,12,13,14, 15 , 16 , 17.
Transparência e fácil manipulação genética de embriões de zebrafish provaram para ser inestimáveis traços ao estudar as vias genéticas e moleculares que regulam o destino da célula, crescimento do tecido e o desenvolvimento do início embrião1,2 ,3. Como tais, as técnicas tradicionais Visualizar transcrições da proteína e do gene, tais como a hibridação in situ e toda montagem se, tem sido aplicado a e otimizado para o zebrafish16,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,37,38. Combinando protocolos populares para peixe e se, é possível rotular e analisar MCCs na vivo16,28,37,38.
O protocolo detalhado acima é otimizado para a rotulagem MCCs na pronephros com transcrições de odf3b e α-tubulina em 24 embriões de zebrafish hpf. Para os melhores resultados, é recomendável usar embriões recém fixos e preparados. Os embriões que foram fixados e armazenados em MeOH ou Hyb + a-20 ° C por mais de uma semana podem ser usados, mas a probabilidade de fundo indesejado coloração aumenta com o tempo que os embriões são mantidos no armazenamento.
Modificações e solução de problemas desta técnica são necessários para adaptar esse método para outros conjuntos de marcadores particulares, por exemplo, outros riboprobes antisentido e outros anticorpos. Muitos métodos para ajustar os parâmetros das etapas no processo de hibridação de toda montagem in situ têm sido documentadas anteriormente pelo nosso grupo e outros31,34,36,38, 39. Da mesma forma, cada anticorpo da proteína vai exigir um pouco de solução de problemas em termos de coloração vezes e intervalos aproximados de diluições e tempos de incubação para cada anticorpo primário são melhor estimados pela avaliação de resultados documentados28, 35. para embriões mais jovens do que 24 hpf, tratamento de pK deve ser inferior a 2 min, onde mais de 24 embriões hpf deve ser tratados com pK por mais de 2 min. Além disso, os embriões mais velhos do que 24 hpf deve ser branqueada de pigmento antes do tratamento de pK.
Após a coloração com a solução de coloração fluorescente, é fundamental para remover qualquer mancha remanescente, anticorpo e peroxidases, realizando a série de lavagens de metanol e água oxigenada. As lavagens de PBS imediatamente a seguir são vitais para remover o metanol em excesso de embriões. Importante, antes de prosseguir com os anticorpos se, encontramos que a acetona e água desionizada lavagens fazem os menos propensos a aderir a um outro e/ou os tubos de centrífuga de embriões. Em nossa experiência, anticorpos para fatores de transcrição específicos e outros genes, embora eles podem trabalhar eficientemente borrões ocidentais, não funcionam bem pelo IF o zebrafish. No entanto, proteínas altamente conservadas e abundantes, como α-tubulina e β-catenina, funcionam bem no zebrafish para se16,37.
Com peixes, é possível visualizar os transcritos de RNA de genes que ainda não tem anticorpos específicos no zebrafish. Combinando peixes com se, como demonstrado pelo presente protocolo, localização co de transcritos de RNA e proteína pode ser visto na vivo (Figura 2). A natureza flexível do protocolo permite a rápida resolução de problemas para a visualização de diversas transcrições de RNA e proteínas em diversos tecidos e pontos de tempo. Quando combinado com os traços já respeitados de embriões de peixe-zebra, este protocolo de peixe + se oferece outra ferramenta para explorar a expressão dos genes e proteínas importantes para o Regulamento do caminho do desenvolvimento.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado em parte pela subvenção R01DK100237 para RAW e o não nacional ciência Fundação pós-graduação Research Fellowship. DGE-1313583 para A.N.M. Agradecemos também a faculdade de ciência graduação pesquisa Fellowship programa de verão para suporte para Magal Gostaríamos de agradecer o centro Zebrafish pesquisa na Universidade de Notre Dame para seus cuidados dedicado de nosso zebrafish. Também gostaríamos de agradecer o departamento de ciências biológicas, bem como os membros do nosso laboratório para todos de apoio e informações valiosas.
non-specific protease mixture solution | Roche | 11459643001, pronase from Streptomyces griseus | Dilute in E3 without methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20°C |
E3 solution | Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination | ||
tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Fluka | A5040-250G | To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL |
embryo dishes | VWR | 351029 | |
5 mL glass vials | Wheaton | 225012 | |
disposable plastic Pasteur pippettes | VWR | 414004-004 | |
4% paraformaldehyde (PFA) solution | Electron Microscopy Services | 19210 | Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20°C. Do not refreeze once thawed for use. |
10X PBS | American Bioanalytical | AB11072 | Dilute in distilled water to make a 1X stock |
Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water. |
1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST) | Sigma | P9416 | 0.1% Tween-20 in 1X PBS |
methanol (MeOH) | Sigma | 34860-4L | |
proteinase K | Roche | 3115879001 | Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20°C |
flat bottom microcentrifuge tubes | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
formamide | American Bioanalytical | AB00600 | store at -20°C |
hybridization solution (HYB+) | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 μg/μL heparin; store at -20°C | ||
hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10Q | |
20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution | American Bioanalytical | AB13156 | dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks |
blocking reagent solution | Roche | 11096176001 | dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4°C |
maleic acid buffer solution | Sigma | M0375 and S7653 | 150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5) |
anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | store at 4°C |
Cy3 fluorescent staining solution | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system | store at 4°C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer |
Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma | H1009-500mL | store at 4°C |
molecular grade distilled water (ddH2O) | Mediatech | 25-055-CM | |
acetone | American Bioanalytical | AB00636-01000 | store an aliquot at -20°C |
DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438-034 | aliquot and store at -20°C |
monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1 | Sigma-Aldrich | T6793 | aliquot and store at -20°C |
anti-γ-tubulin anitbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | T5192 | aliquot and store at -20°C |
odf3b cDNA clone MGC:63985 | OpenBiosystems | IMAGE:6792478 | store bacterial glycerol stock at -80°C |
NaCL | American Bioanalytical | AB01915-05000 | |
Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | store at 4°C; protect from light |
Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11029 | store at 4°C; protect from light |
DAPI | Life Technologies | D1306 | aliquot and store at -20°C |
glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | |
glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
mounting media | Polysciences, Inc. | 18606, Aqua-Poly/Mount | store at 4°C |
confocal microscope and associated software | We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software | ||
rocker | Bio-Rad | 1660710EDU |