Sviluppo di ciglia è vitale per l’organogenesi corretto. Questo protocollo descrive un metodo ottimizzato per etichettare e visualizzare le cellule ciliate di zebrafish.
Negli ultimi anni, l’embrione di zebrafish è emerso come un modello popolare per studiare biologia inerente allo sviluppo a causa di caratteristiche quali la ex utero lo sviluppo dell’embrione e trasparenza ottica. In particolare, l’embrione di zebrafish è diventato un organismo importante per studiare l’organogenesi renale vertebrati, nonché lo sviluppo delle cellule multiciliated (MCC). Per visualizzare MCCs nel rene embrionale zebrafish, abbiamo sviluppato un protocollo combinato di ibridazione del intero-supporto fluorescente in situ (FISH) e montare tutto immunofluorescenza (IF) che permette l’imaging ad alta risoluzione. Questo manoscritto descrive la nostra tecnica per la co-localizzazione di trascritti di RNA e proteine come strumento per comprendere meglio la regolamentazione dei programmi di sviluppo attraverso l’espressione di vari fattori di lignaggio.
Nel corso degli ultimi decenni, il pesce zebra (Danio rerio) è emerso come un organismo il primo modello per studiare biologia inerente allo sviluppo. Gli embrioni si sviluppano di fuori della madre e sono otticamente trasparenti. Inoltre, la formazione di organi vitali come l’occhio, il rene e il proencefalo si verifica rapidamente, con strutture formate da solo 24 h post fertilizzazione (hpf). D’importanza, il genoma di zebrafish è altamente conservato con mammiferi1,2,3. Inoltre, zebrafish e organi mammiferi hanno simili anatomia e fisiologia. Il rene embrionale di zebrafish, o pronephros, dimostra il valore del sistema modello per l’esame di funzione del gene durante primi nefrogenesi e determinazione di destino delle popolazioni di cellule epiteliali conservata del nefrone vertebrati4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. allo stesso modo, l’embrione di zebrafish è diventato sempre più importante nell’esaminare l’ontogenesi di MCCs11,12,13,14,15, 16 , 17.
Come suggerisce il loro nome, MCCs sono cellule epiteliali, caratterizzate da un fascio di ciglia mobili situato sulla superficie apicale17. In zebrafish, MCCs funzionare in flusso di fluido e sono disperse in un “sale e pepe” come la moda in tutta la metà di ogni nefrone dei pronephros da 24 hpf11,12,13,14, 15 , 16 , 17. anche se essi sono stati notati solo in una manciata di rene umano malattia casi18,19,20,21, MCCs sono prevalenti in altri tessuti di mammiferi come il cervello e trachea22,23,24, che pone una serie di sfide per il disegno sperimentale. Elegante in vari modelli vertebrati compreso zebrafish hanno dimostrato una via conservata del destino MCC, con la tacca via di segnalazione come inibitore di MCC sviluppo12,17,25 ,26,27. Di conseguenza, i pronephros zebrafish fornisce un modello facilmente accessibile per studiare i meccanismi genetici di MCC sviluppo in vivo11,12,13,14, 15 , 16 , 17.
Trasparenza e facile manipolazione genetica degli embrioni di zebrafish hanno dimostrato di essere tratti inestimabile quando si studia le vie genetiche e molecolari che regolano il destino delle cellule, la crescita dei tessuti e lo sviluppo del primo embrione1,2 ,3. Come tali, tecniche tradizionali per visualizzare trascrizioni del gene e della proteina, quali ibridazione in situ e intero monte se, sono stati applicati a e ottimizzato per il Danio rerio16,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,37,38. Combinando i più diffusi protocolli per pesce e se, è possibile aggiungere etichette e analizzare MCCs in vivo16,28,37,38.
Il protocollo descritto sopra è ottimizzato per l’etichettatura MCCs in pronephros con odf3b trascrizioni e α-tubulina in embrioni di zebrafish 24 hpf. Per ottenere risultati ottimali, si consiglia di utilizzare embrioni appena fissi e preparati. Gli embrioni che sono stati corretti e immagazzinati in MeOH o IBRID + a-20 ° C per più di una settimana possono essere utilizzati, ma la probabilità di sfondo indesiderati macchiatura aumenta con il tempo che gli embrioni sono conservati in deposito.
Le modifiche e la risoluzione dei problemi di questa tecnica sono necessarie per adattare questo metodo per altre suite di particolari marcatori, ad es. altri riboprobes antisenso e altri anticorpi. Molti metodi per regolare i parametri delle fasi del processo intero supporto ibridazione in situ sono stati documentati in precedenza dal nostro gruppo ed altri31,34,36,38, 39. Allo stesso modo, ogni anticorpo proteina richiederà alcuni risoluzione dei problemi in termini di tempi di trattamento, e approssimative gamme di diluizioni e tempi di incubazione per ogni anticorpo primario migliori sono stimate dalla valutazione di risultati documentati28, 35. per gli embrioni di età inferiore ai 24 hpf, pK trattamento dovrebbe essere inferiore a 2 min, dove oltre 24 anni di embrioni hpf devono essere trattati con pK per più di 2 min. Inoltre, gli embrioni oltre 24 hpf dovrebbe essere sbiancato di pigmento prima del trattamento di pK.
Dopo colorazione con la soluzione colorante fluorescente, è fondamentale per rimuovere qualsiasi restante macchia, anticorpo e perossidasi eseguendo la serie di lavaggi di metanolo e perossido di idrogeno. I lavaggi di PBS immediatamente successivi sono vitali per rimuovere il metanolo in eccesso da embrioni. Importante, prima di procedere con gli anticorpi se, abbiamo trovato che l’acetone e risciacqui con acqua deionizzata rendono gli embrioni meno tendono ad aderire l’un l’altro e/o le provette da centrifuga. Nella nostra esperienza, gli anticorpi per specifici fattori di trascrizione e di altri geni, anche se potrebbero funzionare in modo efficiente macchie occidentali, non funzionano bene per se in zebrafish. Tuttavia, proteine altamente conservate e abbondanti, come α-tubulina e β-catenina, funzionano bene in zebrafish per se16,37.
Con il pesce, è possibile visualizzare trascrizioni del RNA dei geni che non hanno ancora gli anticorpi specifici in zebrafish. Combinando il pesce con se, come dimostrato dal presente protocollo, co-localizzazione di trascritti di RNA e proteine può essere visto in vivo (Figura 2). La natura flessibile del protocollo consente la rapida risoluzione dei problemi per la visualizzazione dei vari trascritti di RNA e proteine in numerosi tessuti e intervalli di tempo. Quando combinato con i tratti già rispettati di embrioni di zebrafish, questo protocollo di pesce + se fornisce un altro strumento per esplorare l’espressione di geni e proteine importanti per via dello sviluppo.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato in parte dalla concessione R01DK100237 R.A.W e il National Science Foundation Graduate ricerca Fellowship No. DGE-1313583 di Raffaele Ringraziamo anche il College di Scienze Undergraduate Research Fellowship programma estivo per supporto per M.U. Vorremmo ringraziare il centro per la ricerca di Zebrafish presso l’Università di Notre Dame per la loro cura dedicato del nostro zebrafish. Vorremmo anche ringraziare il dipartimento di scienze biologiche, come pure i membri del nostro laboratorio per tutte le loro supporto e informazioni preziose.
non-specific protease mixture solution | Roche | 11459643001, pronase from Streptomyces griseus | Dilute in E3 without methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20°C |
E3 solution | Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination | ||
tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Fluka | A5040-250G | To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL |
embryo dishes | VWR | 351029 | |
5 mL glass vials | Wheaton | 225012 | |
disposable plastic Pasteur pippettes | VWR | 414004-004 | |
4% paraformaldehyde (PFA) solution | Electron Microscopy Services | 19210 | Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20°C. Do not refreeze once thawed for use. |
10X PBS | American Bioanalytical | AB11072 | Dilute in distilled water to make a 1X stock |
Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water. |
1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST) | Sigma | P9416 | 0.1% Tween-20 in 1X PBS |
methanol (MeOH) | Sigma | 34860-4L | |
proteinase K | Roche | 3115879001 | Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20°C |
flat bottom microcentrifuge tubes | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
formamide | American Bioanalytical | AB00600 | store at -20°C |
hybridization solution (HYB+) | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 μg/μL heparin; store at -20°C | ||
hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10Q | |
20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution | American Bioanalytical | AB13156 | dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks |
blocking reagent solution | Roche | 11096176001 | dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4°C |
maleic acid buffer solution | Sigma | M0375 and S7653 | 150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5) |
anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | store at 4°C |
Cy3 fluorescent staining solution | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system | store at 4°C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer |
Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma | H1009-500mL | store at 4°C |
molecular grade distilled water (ddH2O) | Mediatech | 25-055-CM | |
acetone | American Bioanalytical | AB00636-01000 | store an aliquot at -20°C |
DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438-034 | aliquot and store at -20°C |
monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1 | Sigma-Aldrich | T6793 | aliquot and store at -20°C |
anti-γ-tubulin anitbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | T5192 | aliquot and store at -20°C |
odf3b cDNA clone MGC:63985 | OpenBiosystems | IMAGE:6792478 | store bacterial glycerol stock at -80°C |
NaCL | American Bioanalytical | AB01915-05000 | |
Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | store at 4°C; protect from light |
Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11029 | store at 4°C; protect from light |
DAPI | Life Technologies | D1306 | aliquot and store at -20°C |
glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | |
glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
mounting media | Polysciences, Inc. | 18606, Aqua-Poly/Mount | store at 4°C |
confocal microscope and associated software | We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software | ||
rocker | Bio-Rad | 1660710EDU |