פיתוח cilia חיוני organogenesis נכונה. פרוטוקול זה מתאר שיטת אופטימיזציה תווית, דמיינו תאים ciliated של דג זברה.
בשנים האחרונות התפתחה העובר דג זברה מודל פופולרי ללמוד ביולוגיה התפתחותית בשל תכונות כמו האקסית עם רחם התפתחות העובר ועל שקיפות אופטית. בפרט, העובר דג זברה הפך אורגניזם חשוב ללמוד כליות חוליות organogenesis, כמו גם פיתוח תא multiciliated (MCC). כדי להמחיש MCCs בכליות דג זברה עובריים, אנו פיתחו פרוטוקול משולב כולה-הר פלורסנט בחיי עיר הכלאה (דג), כל הר immunofluorescence (אם) המאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה. כתב יד זה מתאר את הטכניקה שלנו עבור שיתוף לוקליזציה תעתיקים RNA וחלבון ככלי להבין טוב יותר את התקנון של תוכניות התפתחותיות דרך הביטוי של שושלת היוחסין גורמים שונים.
בעשורים האחרונים, דג זברה (רזבורה rerio) התפתחה כאורגניזם מודל הממשלה ללמוד ביולוגיה התפתחותית. העוברים לפתח מחוץ האמא, שקוף אופטית. כמו כן, היווצרות של איברים חיוניים כגון עיניים, כליות, ו הקדמי מתרחשת במהירות, עם מבנים הנוצרת על-ידי רק 24 שעות שלאחר ההפריה (hpf). חשוב מאוד כולו הגנום דג זברה עם יונקים1,2,3. בנוסף, דג זברה ואיברים יונקים שיהיה דומה אנטומיה ופיזיולוגיה. הכליה מתחלקים דג זברה, או pronephros, מדגים את הערך של מערכת מודל לבחינת תפקוד הגן במהלך nephrogenesis מוקדם ונחישות הגורל של אוכלוסיות תאים אפיתל שנשמרת נפרון חוליות4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. באופן דומה, העובר דג זברה הפך להיות חשוב יותר ויותר כשבוחנים את ontogeny של MCCs11,12,13,14,15, 16 , 17.
כפי שמרמז שמם, MCCs הם תאים אפיתל מאופיין על ידי צרור של תאי cilia ממוקם על פני שטח הפסגה17. דג זברה, MCCs לתפקד זרימת נוזלים, מופצים ב- “ש” כמו אופנה ברחבי האמצע של כל נפרון של pronephros ע י 24 hpf11,12,13,14, 15 , 16 , 17. למרות שהם רק כבר ציינו בקומץ של כליה אנושית למחלה מקרים18,19,20,21, MCCs נפוצים ברקמות יונקים אחרים כמו המוח, קנה הנשימה22,23,24, אשר מהווה שורה של אתגרים עבור תכנון ניסויים. אלגנטי מחקרים במודלים חוליות שונות, כולל דג זברה הראו שביל ההכפלה של גורל MCC, עם החריץ איתות כמו מעכב MCC פיתוח12,17,25 ,26,27. לכן, pronephros דג זברה מספק מודל נגיש בקלות ללמוד את מנגנונים גנטיים MCC פיתוח ויוו11,12,13,14, 15 , 16 , 17.
שקיפות והן מניפולציה גנטית קלה של דג זברה העוברים הוכיחו להיות תכונות שלא יסולא בפז כשלמדתי המסלולים גנטית ומולקולרית המסדירים גורל, רקמה והתפתחות מוקדמת העובר1,2 ,3. בתור שכזה, טכניקות מסורתיות כדי להמחיש תעתיקים וג’ין, חלבון, כמו הכלאה בחיי עיר ואם הר שלמה, יש כבר חלה על אופטימיזציה עבור דג זברה16,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,37,38. על ידי שילוב פרוטוקולים פופולרי עבור דגים ואם, זה אפשרי לשים תווית ולנתח MCCs ויוו16,28,37,38.
פרוטוקול שתוארו לעיל ממוטב תיוג MCCs ב pronephros עם odf3b תעתיקים וα-טובולין ב 24 hpf דג זברה עוברי. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, מומלץ להשתמש העוברים טריים קבועים ובלתי מוכן. עוברי קבוע, מאוחסנים או MeOH או Hyb + ב-20 ° C יותר מאשר שבוע אחד יכול לשמש, אך ההסתברות של הרקע הבלתי רצויים מכתים גדל עם הזמן העוברים נשמרים במחסן.
שינויים ופתרון בעיות של טכניקה זו יש צורך להתאים שיטה זו עבור חבילות אחרות של סמני מסוים, למשל אחרים riboprobes antisense, נוגדנים אחרים. שיטות רבות על התאמת הפרמטרים של שלבים בתהליך הר שלמה בחיי עיר הכלאה היו שתועד בעבר על ידי הקבוצה שלנו ועוד31,34,36,38, 39. באופן דומה, כל נוגדן חלבון ותחייב פתרון בעיות כלשהו מבחינת צביעת פעמים ולאחר טווחים משוער של דילולים והשעות הדגירה עבור כל נוגדן ראשוני הכי מוערך על ידי הערכה של תוצאות מתועדים28, 35. עבור עוברי צעיר יותר 24 hpf, pK הטיפול צריך להיות קצר יותר מאשר 2 דקות, שבו עוברי שגילם 24 hpf צריכים להיות מטופלים עם pK יותר מ 2 דקות. בנוסף, העוברים שגילם 24 hpf צריך להיות מולבן של פיגמנט לפני הטיפול pK.
לאחר צביעת עם הפתרון מכתימים פלורסנט, חיוני כדי להסיר כל הנותרים הכתם נוגדן, peroxidases על-ידי ביצוע הסדרה של מנקי מתנול, מימן על-חמצני. מנקי PBS מיד לאחר הכרחיים כדי להסיר מתנול עודפי העוברים. חשוב לציין, לפני שתמשיך עם נוגדנים אם, מצאנו כי אצטון על יונים מים שוטף לעשות את העוברים פחות סביר לדבוק אחד לשני ו/או הצינורות צנטריפוגה. הניסיון שלנו, נוגדנים עבור גורמי שעתוק ספציפיים, גנים אחרים, למרות שהם יפעלו ביעילות אצל לחומה המערבית, לא עובד היטב עבור אם דג זברה. עם זאת, חלבונים שנשמרת מאוד, שופע, כגון טובולין α וβ-catenin, עובד היטב את דג זברה עבור אם16,37.
דג זה אפשר לדמיין RNA תעתיקים של גנים אשר עדיין אין נוגדנים ספציפיים ב- דג זברה. על ידי שילוב של דגים עם אם, כפי שמתואר על ידי פרוטוקול זה, שותף לוקליזציה של תעתיקים RNA וחלבון ניתן לראות ויוו (איור 2). הטבע גמיש של הפרוטוקול מאפשר פתרון מהיר עבור הפריט החזותי של RNA תעתיקים שונים חלבונים ברקמות רבות, נקודות זמן. בשילוב עם התכונות כבר מכובד של דג זברה העוברים, פרוטוקול זה של דגים + אם מספק כלי נוסף כדי לחקור את הביטוי של גנים, חלבונים חשובים את מסלול התפתחותי רגולציה.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמך בחלקה על ידי המענק R01DK100237 ועד R.A.W. הלאומי למדע קרן לתואר שני מחקר מלגת לנתיב הימני. DGE-1313583 אל A.N.M. אנו מודים גם המכללה של המדע הקיץ לתואר ראשון מחקר תכנית העמיתים לתמיכה M.U. ברצוננו להודות למרכז לחקר דג זברה-אוניברסיטת נוטרה דאם לטיפול ייעודי שלהם של דג זברה שלנו. כן נרצה להודות במחלקה למדעי הביולוגיה, כמו גם חברי המעבדה שלנו לכולם על התמיכה ועל תובנות בעלות ערך.
non-specific protease mixture solution | Roche | 11459643001, pronase from Streptomyces griseus | Dilute in E3 without methylene blue to make 50mg/mL stock solution; store at -20°C |
E3 solution | Dilute 50X E3 (250 mM NaCl, 8.5 mM KCl, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water) in distilled water; add 1 x 10-5 M methylene blue (sigma M9140) to inhibit contamination | ||
tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Fluka | A5040-250G | To make a 0.2% stock solution, dissolve 1 g of tricaine powder in 10 mL Tris, pH 9.5 and distilled water up to 500 mL |
embryo dishes | VWR | 351029 | |
5 mL glass vials | Wheaton | 225012 | |
disposable plastic Pasteur pippettes | VWR | 414004-004 | |
4% paraformaldehyde (PFA) solution | Electron Microscopy Services | 19210 | Dissolve 4% PFA in 1X PBS and bring to a boil under a fume hood. Cool and aliquot, then store at -20°C. Do not refreeze once thawed for use. |
10X PBS | American Bioanalytical | AB11072 | Dilute in distilled water to make a 1X stock |
Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | Make a 0.1% Tween-20 stock by diluting in distilled water. |
1X phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBST) | Sigma | P9416 | 0.1% Tween-20 in 1X PBS |
methanol (MeOH) | Sigma | 34860-4L | |
proteinase K | Roche | 3115879001 | Dissolve in distilled water to make a 10 mg/mL stock; aliquot and store at -20°C |
flat bottom microcentrifuge tubes | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
formamide | American Bioanalytical | AB00600 | store at -20°C |
hybridization solution (HYB+) | 50% formamide, 5X SSC, 0.1% Tween-20, 5 mg/mL yeast torula RNA, 50 μg/μL heparin; store at -20°C | ||
hybridization oven | Fisher Scientific | 13-247-10Q | |
20X saline-sodium citrate (SSC) buffer solution | American Bioanalytical | AB13156 | dilute in distilled water to make 2X and 0.2X stocks |
blocking reagent solution | Roche | 11096176001 | dilute in maleic acid buffer to make a 10% stock solution; store at 4°C |
maleic acid buffer solution | Sigma | M0375 and S7653 | 150mM maleic acid, 100mM NaCl (pH 7.5) |
anti-Digoxigenin-POD, Fab fragments | Roche | 11207739910 | store at 4°C |
Cy3 fluorescent staining solution | PerkinElmer, Inc. | NEL744001KT, TSA Plus Cyanin3 system | store at 4°C; prepare staining solution fresh by making a 1:50 dilution of TSA reagent (dissolved in 60 uL of DMSO) in the kit buffer |
Hydrogen peroxide (H2O2) | Sigma | H1009-500mL | store at 4°C |
molecular grade distilled water (ddH2O) | Mediatech | 25-055-CM | |
acetone | American Bioanalytical | AB00636-01000 | store an aliquot at -20°C |
DMSO | American Bioanalytical | AB00435-01000 | |
fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10438-034 | aliquot and store at -20°C |
monoclonal anti-acetylated tubulin clone 6-11B-1 | Sigma-Aldrich | T6793 | aliquot and store at -20°C |
anti-γ-tubulin anitbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | T5192 | aliquot and store at -20°C |
odf3b cDNA clone MGC:63985 | OpenBiosystems | IMAGE:6792478 | store bacterial glycerol stock at -80°C |
NaCL | American Bioanalytical | AB01915-05000 | |
Alexa flour 647 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21245 | store at 4°C; protect from light |
Alexa fluor 488 goat anti-mouse IgG | Life Technologies | A11029 | store at 4°C; protect from light |
DAPI | Life Technologies | D1306 | aliquot and store at -20°C |
glass slide | Thermo-Fisher | 4445 | |
glass coverslip | Thermo-Fisher | 12-540A | 18 x 18 mm |
fine forceps | Roboz | RS-1050 | Dumont Tweezers Pattern #55 |
mounting media | Polysciences, Inc. | 18606, Aqua-Poly/Mount | store at 4°C |
confocal microscope and associated software | We use a Nikon C2plus Confocal Microscope with NIS-elements AR software | ||
rocker | Bio-Rad | 1660710EDU |