Tetradların Barkod Etkin Sıralama (BEST), izole bozan ve tetradların aralanması manuel süreçleri değiştirir. İYİ, agar plakaları üzerine sıralama floresan-aktive edilmiş hücre tarafından iki baştan izole cam boncuklar ile çalkalama ile sporlar ayırır ve rasgele dizilmiş koloniler moleküler barkod ile aynı orijinal tetrat türetildi belirler.
Tetrad analiz maya genetiği için değerli bir araçtır, ancak sürecin zahmetli manuel doğa büyük ölçeklerde başvurusunu engellemiştir. Barkod tetradların sekanslanması (BEST) 1, izole bozan ve tetradların aralanması manuel süreçleri Etkin. İYİ doğrudan ascus enzimatik olarak sindirilir ve sporlar bozulur ve rastgele cam boncuk dizilmiş kaplama ile agar plakalar üzerine tetratların floresan-aktive edilmiş hücre sıralama izin veren bir sporülasyon özel GFP füzyon proteini sayesinde iki baştan izole eder. Sporlar genotiplemesi sırasında okunan moleküler barkod kullanarak, aynı tetrat kökenli yani bilgi hangi haploid kolonileri sonra, kardeş spor ilişkiler atanır. Manuel diseksiyon darboğaz kaldırarak, tetratların yüzlerce veya hatta binlerce dakika içinde izole edilebilir. Burada maya İYİ gerçekleştirmek için gerekli deneysel prosedürleri ayrıntılı bir açıklama sunmakSaccharomyces cerevisiae, haploid öz değişmesine ait soyundan türetilen koloni izolasyonu ile bir heterozigot diploid suşu ile başlayarak.
Yaygın tetrad analizi olarak bilinen Mayotik gen haritalama, maya genetik merkezidir. Kısaca, her biri, her kromozomun tek bir kopyasını içeren iki haploid suşları, her kromozomdan iki kopya, her ebeveynden biri ile bir heterozigot diploid gerginlik oluşturmak için evlendirilen. Azot için diploid hücreler açlıktan kromozomlar, yinelenen yeniden düzenlenmesini geçmesi ve her ebeveyn alellerin yeni kombinasyonları ile dört haploit hücreleri (sporlar veya ayırımlarındaki) bölün (sporulasyon) hangi mayoz neden olur. Tek bir mayoz kaynaklanan dört sporlar tetrad adı verilen bir manuel işlemle izole edilebilir.
1937 yılında 4 orijinal yayınlanmasından bu yana nispeten daha az değişti Konvansiyonel tetdar diseksiyonu 2,3, üç hedefi vardır. İlk olarak, mayoz (tetradların) geçirmiş hücreleri vejetatif hücrelerin bir arka plan uzak izole edilmelidir. Geleneksel analizde, bu kullanarak, kim bir araştırmacı tarafından gerçekleştirilirBir mikroskop, görsel olarak bir agar plaka üzerinde iki baştan tanımlar ve bir mikromanipülatör cihaz görsel bir agar plaka üzerinde iki baştan belirlenmesi ve plaka bir hücre içermeyen alanı üzerine tetrad taşımak için bir mikro manipülatörün kullanılması kullanmaktadır. Daha sonra, Tetrad dört sporlar fiziksel interspore çiftleşme önlemek için ayrılmalıdır. Bir tetrad içindeki sporları bir TSKB'lerin, orijinal diploid hücrenin hücre duvarının kalıntısı ve interspore köprü 5, bir dizi her ikisi tarafından bir arada tutulur. Geleneksel tetrad analizde ascus enzimatik sindirimi ile çıkarıldı ve bir araştırmacı interspore köprüleri kırmak ve sporlar ayrı takılmak mikromanipülatör kullanır. Son olarak, bireysel sporlar sporlar arasındaki ilişkiyi korur bir ızgarah model halinde dizilirler, dört bir satırda, yani tüm döl aynı orijinal tetrat kardeş sporlar. Deneyimli bir maya araştırmacı 10 tetradların (genel kabul görmüş en az sayıda diseksiyon işlemini tamamlayabilirsinizYaklaşık 15 dakika içinde) haç başına.
Biz 1 (BEST) T etrads arasında nabled S equencing B ARCODE E dediğimiz yeni bir yüksek verimli tetdar genotiplendirme yöntemi geliştirdik. İYİ izole döl çok sayıda, genotip, ve dört öz değişmesine ait ürünlerin kardeş spor ilişkileri geri olanak sağlayan bir şekilde, bireysel olarak muhafaza oluşumunu ve genotipleme sağlayarak yüksek verimli genetik mevcut yöntemler genişletmektedir. Bu üç temel strateji (Şekil 1) kullanılarak gerçekleştirilir. Üretim GFP ile mayoz geçirmiş hücreler etiketler ve onları (FACS) floresan-aktive edilmiş hücre ile izole edilebilir sağlayan bir raportör konstruktunun giriştir. İkinci bir tetdar dört sporları iletilir ve rekombinant Progen bir DNA dizilemesi ile okunabilir bir biçimde son derece karmaşık bir DNA barkod eklenmesi (15 rasgele bir nükleotid string) olduğuBöylece y ve aynı tetrat ikinci kardeş sporlar tanımlar. Üçüncü genotiplendirme adımdır, ve en iyi yakalayan genomik işaretleri bir dizi yanı sıra tetdar özel barkod hem de çok sayıda genotiplendirme platformları ile uyumludur. Biz, böylece tutarlı, 2-3 döl soylarının genomunun% yanı sıra yakalama, bir kısıtlama alanı ile ilişkili etiket DNA dizilemesi (RAD-seq) belirli bir kısıtlama bölge 1 için genom sekanslama yönlendirir 6 yöntemi kullanan plazmid kaynaklı barkod . Çapraz deneysel olarak türetilmiş genotipleme verileri ile birlikte tetrad ilişkilerinin geri düşük sıra kapsamı ile belirteçlerin durumu ve inviable (ve dolayısıyla kurtarılamaz) bireylerin dahil olmak üzere, komple genotip eksik bilgilerin doğru bir çıkarım sağlar. Burada, öz değişmesine ait eşleme için en yaygın olarak kullanılan mikroorganizma, maya S. yöntemin uygulanmasını tarif cerevisiae. Bununla birlikte, organizma özgü rea küçük ikameleri ileGent, GFP ile kaynaşmış, örneğin farklı sporlaşma-spesifik proteinler, yöntem, öz değişmesine ait eşleme yoğun ya da şu anda çok daha dirençli iş olduğu organizmalar dahil olmak üzere diğer mikroorganizmalar, kolaylıkla devredilecek olmalıdır.
Şekil 1. Iyi yöntem. (A) plazmid pCL2_BC bir sporülasyon özel GFP füzyon, G418'e karşı direnç ve bir 15-mer rastlantısal barkod ile 2 mikron plazmiddir. Plazmid kütüphane yapımı Ludlow et al 1 'de tarif edilmektedir. (B) Barkodlanan plasmidin bir havuz bir çapraz diploid soy dönüştürülmüştür. (C) Transformantlar daha sonra seçime yetiştirilir ve ~ 10000 dönüştürülmüş koloniler bir araya toplanmış ve sporule edilir. Mayoz bölünme sırasında tetrat her spor bir co devralırBarkodlanan plazmid py. (D) iki baştan FACS ile unsporulated hücrelerinden ayrılan ve sindirildi ve her spor bir koloni oluşturmak için izin bozulmuş agar plakaları üzerinde toplanır. (E) koloniler daha sonra, 96-gözlü levhalar içine toplanmıştır fenotiplenebilmektedir ve genotipleme edilir. Genotiplenmesi sırasında plasmid barkod okumak ve her tetrat dört üyelerini tespit etmek için kullanılır. Bu rakam Ludlow ark 1 modifiye edilmiştir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Karmaşık özellik eşleme 11 DNA rekombinasyonu 12 altında yatan mekanizmaların çalışmaya kadar genetik araştırma birçok alanda, döl son derece büyük sayıda ve DNA dizilimi yüksek hacim gerektirir. Yüksek verimli DNA sekanslama kapasiteli konvansiyonel yaklaşımlar gücünü evlenmek teknikler daha önce, tedaviye dirençli olan çalışma sağlamak için potansiyele sahiptir. Çeşitli yüksek verimli maya genetik yöntemler özel sorunları etkin bir şekilde tatbik edilmiş olmasına rağmen, geleneksel her tetrad çözümlemesiyle geniş uygulanabilirliği yetersiz kalmaktadır sınırlamaları vardır. Tetrad diseksiyonu birleştirerek yüksek verimlilik yaklaşımı istihdam ve maya haçlar soyunu genotiplenmesi ile İYİ adresleri bu zorlukları. Mültipleksli RAD-tag sıralama ile bağlantılı olarak, İYİ benzersiz tetdar barkod vasıtasıyla tetdar ilişkilerini koruyarak her döl suşu için genotip bilgi toplamaktadır için ucuz bir yol sunar.0; Tüm şu anda yüksek verim yöntemler kullanılır, EN İYİ en yakın bir elle disseke maya haç tarafından sağlanan bilgiler tartışıldı.
İYİ iki önemli özelliklere sahiptir. İlk hızla (Protokol 5-6 adımlar) uzaklıkta kültür içinde unsporulated hücrelerden izole etmek için iki baştan FACS kullanılmasıdır. Floresan olaylar (tetradların) binlerce izole yeteneği İYİ throughput en büyük kazanç sağlar. Bu otomasyon sayesinde görsel nadir olayları tanımlamak için gereken artan zaman, düşük sporulasyon verimlilik ile haç için manuel diseksiyon üzerinde daha büyük bir avantaj sağlamaktadır. İkinci önemli özelliği bir tetrat her kardeş sporun iletilir son derece karmaşık bir moleküler barkod (Protokol Adım 2) kullanılmasıdır. Bu barkod rasgele Elle, düzenli bir ızgara dizisi hücrelerin hafifletilen için, bir agar plaka üzerinde dağıtılmıştır sporlar arasındaki ilişkileri tetrad yeniden hesaplama için kullanılabilir çünkü. Son olarak,moleküler barkod ve sporlaşma spesifik GFP raportör geni fiziksel olarak (aynı plazmid üzerinde) bağlı olduğu için, moleküler barkod muhafaza yalnızca iki baştan FACS sıralama seçilir.
Kültürler sporlaşma ortamının inkübe edilmelidir süreyi yöneten iki önemli nokta vardır. Sporulasyon özel raportör (SPS2-GFP) erken mayoz ifade edilir, çünkü ilk, tek başına GFP mayoz (yani dyads) tamamlamamış hücrelerin tam 4-spor tetradların ayırt etmez. Ek FACS yolluk floresan, eksik tetratların sayısını azaltmak olsa da, bu istenmeyen olayları azaltmak için en kolay yolu sadece sporulasyon kültürünü izleme (3.3 Adım) ve bir kez yeni tetradların oluşturan durdurdu ilerlemektedir. Deneylerde, kriteri dyads sıklığı% 1'den daha az olan. İkincisi, ajitasyon olmadan oda sıcaklığında sporulasyon ortamda harcanan bazı haçlar ek süre SIG (Adım 3.4)istatistiksel olarak anlamlı oranda Aslında bu adım, bazı haçlar bozulması için kesinlikle gerekli olan kaplama sırasında cam boncuk tetratların ayrılması ((Protokol Adım 6). geliştirir.
Tüm yüksek verimli metotlar gibi, İYİ gelen geleneksel yaklaşımından daha "gürültülü" dir. Geleneksel tetrad diseksiyonu karşılaştırıldığında BEST verimliliğinde mütevazı azalma çeşitli faktörlerin kombinasyonları sonucu olabilir. Bir faktör, işlemin mekanik gerilimlere karşı spor ölüm ya da artmış yayılma esnasında cam tanelerine yapışma neden olabilir ki, aksi halde uygun sporların artan kaybıdır. İkinci faktör mayoz sırasında basit plazmid kaybı olabilir. Üçüncü faktör karışık genotipleri ile kolonilerden kaynaklanan kullanılabilir sömürgelerinde etkili bir azalma olabilir, bizim pilot kolonilerin yaklaşık ~ 5% 1 geçer. Bu koloniler kardeş spor ayrılık başarısızlıklarını temsil olasıdır. Çünkü hızlı fluorçeşitli teda sıralama ve spor ayırma tetratların muazzam numaraları koleksiyon izin, İYİ de bu ölçekte verimlilik düşüşler aşmak için donatılmıştır. BEST gelecek tekrarlamalar manuel diseksiyon yaklaşan verimliliği artırmak olsa da, DNA dizileme kapasite mevcut üstel yörünge hızla kullanılabilir gerginlik kaybı bu düzeyde telafi edeceğini belki daha olasıdır. Ne olursa olsun, İYİ uygulanabilir için ölçekte tetdar analizini gerçekleştirmek için yeteneği şu anda manuel yöntemlerle olanaksız olan çalışmaları sağlayacaktır.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma AMD bir NIH / NHGRI Genom Scholar / Fakültesi Geçiş Ödülü (K22 HG002908) ve Sistem Biyolojisi Enstitüsü ve Lüksemburg Üniversitesi arasında bir stratejik ortaklık tarafından desteklenmiştir. Suşları veya plazmidlerden talepleri Aimée Dudley (aimee.dudley @ gmail.com) yöneltilmelidir.
FACSAria II (Special order unit) | BD Biosciences | – | Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto petri dishes (which may need |
Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II) | BD Biosciences | 643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument) | |
Zymolyase 100T | Seikagaku Biobusiness | ||
G418 | A.G. Scientific | http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html |