Barcode ativado Seqüenciamento de Tetrads (BEST) substitui os processos manuais de isolamento, interrompendo e espaçamento tétrades. MELHOR isola tétradas por células activadas por fluorescência em placas de agar, separa os esporos por agitação com esferas de vidro, e determina que as colónias foram dispostas aleatoriamente derivada da mesma tétrade original utilizando códigos de barras moleculares.
Análise Tetrad é uma ferramenta valiosa para a genética de leveduras, mas a natureza manual do laborioso do processo tem dificultado a sua aplicação em grandes escalas. Barcode ativado Seqüenciamento de Tetrads (BEST) 1 substitui os processos manuais de isolamento, interrompendo e espaçamento tétrades. MELHOR isola tétradas em virtude de uma proteína de fusão GFP-specific esporulação que permite activado por fluorescência das células de tétradas directamente em placas de agar, em que o asco é enzimaticamente digeridas e os esporos são interrompidos aleatoriamente e dispostas por conta de vidro chapeamento. As colônias haplóides são atribuídos relações esporos irmã, ou seja, informações sobre quais os esporos originados da mesma tétrade, usando códigos de barras moleculares lidos durante genotipagem. Ao remover o gargalo de dissecção manual, centenas ou mesmo milhares de tétradas pode ser isolado em minutos. Aqui apresenta-se uma descrição detalhada dos procedimentos experimentais necessários para realizar melhor na leveduraSaccharomyces cerevisiae, a começar com uma estirpe diplóide heterozigótico através do isolamento de colónias derivadas da progenitura meiótica haplóide.
Mapeamento genético meiótica, vulgarmente conhecida como análise tetra, é central para a genética do fermento. Resumidamente, duas cepas haplóides, cada um contendo uma única cópia de cada cromossomo, são acoplados para formar uma linhagem diplóide heterozigoto com duas cópias de cada cromossomo, um de cada pai. Starving células diplóides de nitrogênio induz a meiose (esporulação), em que os cromossomos duplicados, sofrer rearranjo, e dividem-se em quatro células haplóides (esporos ou segregantes) com novas combinações de alelos de cada um dos pais. Os quatro esporos resultantes de uma única meiose pode ser isolado por um processo manual chamado dissecção quaternário.
Convencional tétrade 2,3 dissecção que mudou relativamente pouco desde a publicação original em 1937 4, tem três objetivos. Em primeiro lugar, as células que tenham sido submetidos a meiose (tétradas) deve ser isolada a partir de uma distância de fundo das células vegetativas. Na análise convencional, isto é conseguido por um investigador que, usandoum microscópio, identifica visualmente tétradas sobre uma placa de ágar e emprega um aparelho micromanipulador identificar visualmente tétradas sobre uma placa de ágar e usando um micromanipulador para mover o tetra para uma área livre de células da placa. Em seguida, os quatro esporos no quaternário deve ser fisicamente separados para evitar interspore acasalamento. Os esporos dentro de uma tétrade são mantidos juntos por tanto um asco, o remanescente da parede celular da célula diplóide original e um conjunto de pontes interspore 5. Na análise tétrade convencional o asco é removida por digestão enzimática, e pesquisador usa o micromanipulador para quebrar as pontes interspore e separar os esporos. Finalmente, os esporos individuais são dispostos num padrão de grelha que mantém a relação entre os esporos, isto é, toda a progénie de uma linha de quatro esporos são gémeos do mesmo tétrade originais. Uma levedura pesquisador experiente pode concluir o processo de dissecar 10 tétrades (um número mínimo geralmente aceitopor transversal) em cerca de 15 min.
Nós desenvolvemos um novo método tétrade genotipagem de alto rendimento, que chamamos de B ARCODE E nabled equencing S de etrads T (BEST) 1. MELHOR expande os métodos atuais em genética de alto rendimento, permitindo a geração e genotipagem de um grande número de descendentes que são isolados, genotipados, e mantidos como indivíduos de uma forma que permite que as relações de esporos irmã de todos os quatro produtos meióticos de ser recuperado. Isto é realizado utilizando-se três estratégias principais (Figura 1). Primeiro, é a introdução de uma construção repórter que rotula as células que sofreram meiose com GFP e permite que sejam isolados por células activadas por fluorescência (FACS). O segundo é a incorporação de um código de barras de DNA altamente complexa (uma seqüência de 15 nucleotídeos aleatórios) de uma forma que é transmitida para todos os quatro esporos de uma tétrade e pode ser lido por sequenciamento de DNA da Progen recombinantey e, portanto, identifica esporos irmãs da mesma quaternário. Em terceiro lugar está o passo a genotipagem, e MELHOR é compatível com várias plataformas de genotipagem que capturam tanto um conjunto de marcadores genômicos, bem como o código de barras específico do tetra. Empregamos uma restrição associada do local de ADN etiqueta de sequenciação (RAD-SEQ) 6 método que dirige a sequenciação do genoma de sítios de restrição específicos 1, capturando assim uma consistente 2-3% do genoma das estirpes da progenitura, bem como o código de barras à base de plasmídeo . A recuperação das relações tétrade, juntamente com os dados de genotipagem empiricamente derivada do cruzamento permite a inferência de informações precisas em falta, incluindo o status de marcadores com baixa cobertura sequência e o genótipo completo de indivíduos inviáveis (e, portanto, não recuperáveis). Aqui, descrevemos a aplicação do método de o microrganismo mais vulgarmente utilizado para o mapeamento da meiose, a levedura S. cerevisiae. No entanto, com as substituições menores de rea-organismo específicogents, por exemplo, proteínas específicas de esporulação diferentes fundidos a GFP, o método deve ser facilmente transferíveis para outros microrganismos, incluindo os organismos em que o mapeamento meiótica é significativamente mais trabalho intensivo ou actualmente intratável.
Figura 1. Melhor método. (A) O plasmídeo pCL2_BC é um plasmídeo de 2 micra, com uma fusão específica esporulação-GFP, a resistência a G418, e um código de barras 15-mer aleatório. Construção da biblioteca de plasmídeo é descrito em Ludlow et ai 1. (B) Um conjunto de plasmídeos de código de barras é transformado na estirpe diplóide de uma cruz. (C) Os transformantes são então crescidas na selecção e ~ 10.000 colónias transformadas são reunidas e esporuladas. Durante a meiose cada esporo de uma tétrade herda uma copy do plasmídeo com código de barras. (D) Tetrads são separados das células por FACS esporulados e recolhidas em placas de ágar, onde eles são digeridos e rompidas para permitir que cada esporo para formar uma colónia. (E) As colónias são então repicadas para placas de 96 poços, fenotipados, e genotipados. Durante a genotipagem do código de barras é lido plasmídeo e utilizados para identificar os quatro membros de cada tétrada. Este valor foi modificado de Ludlow et al 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Muitas áreas de investigação genética, que variam a partir de complexo de mapeamento traço 11 para o estudo dos mecanismos subjacentes da recombinação de ADN 12, exigem um número extremamente grande de descendência e grandes volumes de sequenciação de ADN. As técnicas que se casam com o poder de abordagens convencionais com a capacidade de alto rendimento de sequenciação do ADN têm o potencial para permitir estudos que foram anteriormente intratável. Apesar de vários de alto rendimento de genética de leveduras métodos têm sido aplicados de forma eficaz para problemas específicos, cada um tem limitações que ficam aquém da ampla aplicabilidade da análise tétrade convencional. MELHORES endereços estes desafios, empregando uma abordagem de alto rendimento, combinando tétrade dissecção e genotipagem da descendência de cruzamentos de leveduras. Em conjunto com multiplexado seqüenciamento RAD-tag, o BEST oferece uma maneira barata de recolher informações genótipo para cada estirpe descendência, preservando as relações tétrade por meio de códigos de barras tétrade únicas.0; De todos os métodos actualmente utilizados rendimento elevado, melhor recapitula mais de perto as informações fornecidas por uma cruz levedura dissecados manualmente.
MELHOR tem duas características principais. A primeira é o uso de FACS para isolar rapidamente tétradas distância a partir de células em cultura esporulados (Protocolo Passos 5-6). A capacidade de isolar milhares de eventos fluorescentes (tetrads) dá melhor o seu maior ganho no rendimento. Esta automação proporciona uma vantagem ainda maior sobre dissecção manual para cruzamentos com baixa eficiência esporulação, devido ao aumento do tempo necessário para identificar visualmente eventos raros. A segunda característica fundamental é o uso de um código de barras molecular altamente complexa (Protocolo Etapa 2) que é transmitida para cada esporo irmã de uma tétrade. Porque estes códigos de barras pode ser usado para reconstruir as relações computacionalmente tétrade entre os esporos que foram distribuídos aleatoriamente através de uma placa de ágar, a necessidade de se manualmente as células da matriz em uma grade ordenada é aliviada. Finalmente,porque o código de barras molecular e o gene repórter da GFP específica do esporulação são fisicamente ligados (no mesmo plasmídeo), apenas tétradas que retiveram o código de barras molecular são seleccionados por separação FACS.
Há duas considerações que determinam a quantidade de tempo que as culturas devem ser incubados no meio de esporulação. Primeiro, porque o repórter específico esporulação (SPS2-GFP) é expressa no início da meiose, sozinho GFP não distingue completos tétrades 4 de esporos a partir de células que não tenham concluído a meiose (ou seja, díades). Enquanto gating FACS adicional pode diminuir o número de fluorescentes, tétrades incompletos, a maneira mais fácil de diminuir esses eventos indesejados é simplesmente monitorar a cultura esporulação (Passo 3.3) e prosseguir uma vez novos tétrades pararam formando. Em nossos experimentos, a freqüência de duplas classificadas é inferior a 1%. Em segundo lugar, para alguns cruzamentos tempo adicional gasto em meio de esporulação na RT sem agitação (Passo 3.4) sigcativamente melhora a separação de tétradas por as pérolas de vidro durante o plaqueamento ((Protocolo Passo 6). Na verdade, este passo é absolutamente necessário para a ruptura de alguns cruzamentos.
Como todos os métodos de rendimento elevado, melhor é "mais ruidoso" do que a abordagem convencional correspondente. A modesta redução na eficiência de melhor em relação a dissecção tétrade convencional pode resultar da combinação de vários fatores. Um fator é o aumento da perda de esporos viáveis de outra forma, o que poderia resultar da adesão às contas de vidro durante a propagação ou aumento da morte de esporos, devido às tensões mecânicas do processo. Um segundo fator pode ser a perda de plasmídeo simples durante a meiose. Um terceiro fator pode ser uma efetiva diminuição nas colônias utilizáveis resultantes de colônias com genótipos mistos, uma estimativa de ~ 5% de colônias em nosso piloto atravessa 1. É provável que essas colônias representam falhas de separação de esporos irmã. Devido à rápida fluorescence triagem e separação de esporos permitir a recolha de um número enorme de tétrades, o BEST está bem equipado para superar diminuição na eficiência nessa escala. Enquanto futuras iterações de melhor poderia aumentar a eficiência que se aproxima de dissecção manual, talvez seja mais provável que a trajetória atual exponencial da capacidade de sequenciamento de DNA irá compensar rapidamente para este nível de perda de tensão utilizável. Independentemente disso, a capacidade de realizar análises tétrade na escala para que melhor pode ser aplicado permitirá estudos que estão atualmente inviável por métodos manuais.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado por uma concessão do NIH / NHGRI Genoma Acadêmico / Faculdade de Transição (K22 HG002908) para AMD e uma parceria estratégica entre o Instituto de Biologia de Sistemas e da Universidade de Luxemburgo. Os pedidos de estirpes ou plasmídeos devem ser dirigidas ao Aimée Dudley (aimee.dudley @ gmail.com).
FACSAria II (Special order unit) | BD Biosciences | – | Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto petri dishes (which may need |
Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II) | BD Biosciences | 643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument) | |
Zymolyase 100T | Seikagaku Biobusiness | ||
G418 | A.G. Scientific | http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html |