Barcode Enabled La secuenciación de Tétradas (BEST) sustituye los procesos manuales de aislamiento, lo que altera y espaciar tétradas. MEJOR aislamientos tétradas por fluorescencia de células activadas por la clasificación en placas de agar, separa las esporas por agitación con perlas de vidrio, y determina qué colonias dispuestas al azar se derivaron de la misma tétrada original utilizando códigos de barras moleculares.
Análisis Tetrad es una herramienta valiosa para la genética de la levadura, pero la naturaleza laborioso manual del proceso ha impedido su aplicación en gran escala. Barcode Enabled La secuenciación de Tétradas (BEST) 1 sustituye los procesos manuales de aislamiento, lo que altera y espaciar tétradas. MEJOR aislamientos tétradas en virtud de una proteína de fusión GFP-esporulación específica que permita activado por fluorescencia de células de clasificación de tétradas directamente sobre placas de agar, en el que el asco es enzimáticamente digeridos y las esporas se interrumpen y aleatoriamente vistió por grano de cristal de recubrimiento. Las colonias haploides se asignan relaciones esporas hermanas, es decir, la información sobre la que las esporas se originaron de la misma tétrada, utilizando los códigos de barras moleculares leídos durante el genotipado. Al eliminar el cuello de botella de la disección manual, cientos o incluso miles de tétradas se pueden aislar en cuestión de minutos. Aquí presentamos una descripción detallada de los procedimientos experimentales necesarios para llevar a cabo mejor en la levaduraSaccharomyces cerevisiae, a partir de una cepa diploide heterocigótico a través del aislamiento de colonias derivadas de la progenie meiótica haploide.
Mapeo de genes meiótica, comúnmente conocida como análisis de tétrada, es central a la genética de la levadura. En resumen, dos cepas haploides, cada uno contienen una sola copia de cada cromosoma, se acoplan para formar una cepa diploide heterocigótico con dos copias de cada cromosoma, uno de cada padre. Morirse de hambre células diploides para el nitrógeno induce meiosis (esporulación) en el que los cromosomas se duplican, se someten a la reordenación, y se dividen en cuatro células haploides (esporas o segregantes) con nuevas combinaciones de alelos de cada padre. Las cuatro esporas resultantes de una sola meiosis se pueden aislar mediante un proceso manual llamado disección tétrada.
Tétrada Convencional 2,3 disección que ha cambiado relativamente poco desde la publicación original en 1937 4, tiene tres objetivos. En primer lugar, las células que han sido sometidos a la meiosis (tétradas) deben ser aislados de distancia de un fondo de células vegetativas. En el análisis convencional, esto se logra por un investigador que, utilizandoun microscopio, identifica visualmente tétradas en una placa de agar y emplea un aparato de micromanipulador identificar visualmente tétradas en una placa de agar y utilizando un micromanipulador para mover la tétrada a una zona libre de células de la placa. A continuación, las cuatro esporas en la tétrada deben estar físicamente separados para evitar el apareamiento interspore. Las esporas dentro de una tétrada se mantienen unidas por tanto un asco, el remanente de la pared celular de la célula diploide original, y un conjunto de puentes interspore 5. En el análisis convencional de la tétrada ascus se elimina por digestión enzimática, y un investigador utiliza el micromanipulador para romper los puentes interspore y desmenuzar las esporas. Finalmente, las esporas individuales están dispuestos en un patrón cuadriculado que mantiene la relación entre las esporas, es decir, toda la progenie en una fila de cuatro esporas son hermanas de la misma tétrada originales. Un investigador de la levadura experimentado puede completar el proceso de disección 10 tétradas (un número mínimo de aceptación generalpor la cruz) en aproximadamente 15 min.
Hemos desarrollado un nuevo método de genotipificación tétrada de alto rendimiento, lo que llamamos B arcode E nabled S equencing de T etrads (BEST) 1. MEJOR expande sobre los métodos actuales de la genética de alto rendimiento al permitir la generación y el genotipado de un gran número de descendientes que son aislados, genotipo, y mantenidos como individuos de una manera que permite a las relaciones de esporas de la hermana de los cuatro productos meióticos que deben recuperarse. Esto se logra mediante tres estrategias principales (Figura 1). En primer lugar es la introducción de un constructo indicador que marca las células que se han sometido a la meiosis con GFP y les permite ser aislados por células activadas por fluorescencia (FACS). En segundo lugar es la incorporación de un código de barras de ADN altamente complejo (una cadena de 15 nucleótidos aleatorios) en una forma que se transmite a todas las cuatro esporas de una tétrada y puede ser leído por la secuenciación del ADN de la Progen recombinantey por lo identifica esporas hermanas de la misma tétrada. En tercer lugar es el paso de genotipado, y lo mejor es compatible con numerosas plataformas de genotipado que capturan tanto un conjunto de marcadores genómicos, así como el código de barras-tétrada específico. Empleamos un sitio de restricción de secuenciación de ADN asociada a la etiqueta (RAD-ss) 6 método que dirige la secuenciación del genoma de sitios de restricción específicos 1, de ese modo la captura de una coherente 2-3% del genoma de las cepas de la progenie, así como el código de barras plásmido transmitidas . La recuperación de las relaciones tétrada junto con los datos de genotipado obtenida de forma empírica desde la cruz permite la inferencia exacta de la información faltante, incluyendo el estado de los marcadores con baja cobertura de secuencia y el genotipo completo de individuos inviables (y por lo tanto no recuperables). Aquí, se describe la aplicación del método en el microorganismo más comúnmente usado para el mapeo de meiótica, la levadura S. cerevisiae. Sin embargo, con las sustituciones menores de rea-organismo específicocaballeros, por ejemplo, diferentes proteínas esporulación específicos fusionados a GFP, el método deben ser fácilmente transferibles a otros microorganismos, incluidos los organismos en los que la cartografía meiótica es significativamente más mano de obra intensiva o actualmente intratable.
Figura 1. Mejor método. (A) El plásmido pCL2_BC es un plásmido de 2 micras con una fusión GFP-esporulación específica, resistencia a G418, y un código de barras aleatorio 15-mer. Construcción de la biblioteca de plásmidos se describe en Ludlow et al 1. (B) Un grupo de plásmidos con código de barras se transforma en la cepa diploide de una cruz. (C) Los transformantes se cultivaron a continuación en la selección y ~ 10.000 colonias transformadas se reúnen y se esporulados. Durante la meiosis cada uno de esporas de una tétrada hereda un copy del plásmido con código de barras. (D) tétradas se separan de las células no esporulados por FACS y se recogieron en placas de agar, donde se digieren y se interrumpieron para permitir que cada uno de esporas para formar una colonia. (E) Las colonias se recogieron a continuación en placas de 96 pocillos, fenotipados, y genotipo. Durante el genotipado del código de barras plásmido se lee y se utiliza para identificar a los cuatro miembros de cada tétrada. Esta cifra ha sido modificado desde Ludlow et al 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Muchas de las áreas de investigación de la genética, que van de cartografía rasgo complejo 11 para el estudio de los mecanismos subyacentes de recombinación de ADN 12, requieren un número extremadamente grande de la progenie y los altos volúmenes de secuenciación de ADN. Las técnicas que se casan con el poder de los enfoques convencionales con la capacidad de alto rendimiento de secuenciación de ADN tienen el potencial de permitir estudios que antes eran intratables. Aunque varios métodos de genética de la levadura de alto rendimiento se han aplicado de manera efectiva a los problemas específicos, cada uno tiene limitaciones que no llegan a la amplia aplicabilidad de análisis tétrada convencional. MEJORES enfrenta a estos retos mediante el empleo de un enfoque de alto rendimiento que combina la disección tétrada y genotipificación de la progenie de cruces de levadura. Junto con multiplexado secuenciación RAD-tag, MEJOR ofrece una manera económica de recoger información del genotipo para cada cepa progenie preservando relaciones tétrada por medio de códigos de barras tétrada únicas.0; De utilizarse toda la actualidad métodos de alto rendimiento, MEJOR recapitula más de cerca la información proporcionada por una cruz de levadura disecados manualmente.
MEJOR tiene dos características fundamentales. El primero es el uso de FACS para aislar rápidamente tétradas de distancia a partir de células no esporulados en la cultura (Protocolo pasos 5-6). La capacidad de aislar miles de eventos fluorescentes (tétradas) da BEST su mayor ganancia en el rendimiento. Esta automatización ofrece una mayor ventaja sobre la disección manual para cruces con baja eficiencia esporulación, debido al aumento del tiempo necesario para identificar visualmente los eventos raros. La segunda característica clave es el uso de un código de barras molecular altamente complejo (Protocolo Paso 2) que se transmite a cada uno de esporas hermana de una tétrada. Debido a que estos códigos de barras pueden utilizarse para computacionalmente reconstruir las relaciones entre tétrada esporas que se han distribuido aleatoriamente a través de una placa de agar, la necesidad de manualmente las células de la matriz en una red ordenada se alivia. Finalmente,debido a que el código de barras molecular y el gen reportero GFP-esporulación específica están vinculados físicamente (en el mismo plásmido), sólo tétradas que han retenido el código de barras molecular se seleccionan por la separación FACS.
Hay dos consideraciones que rigen la longitud de tiempo que los cultivos deben ser incubados en el medio de esporulación. En primer lugar, debido a que el reportero en particular la esporulación (SPS2-GFP) se expresa al principio de la meiosis, solo GFP no distingue completas tétradas 4 de esporas a partir de células que no han completado la meiosis (es decir, las diadas). Mientras gating FACS adicional puede disminuir el número de tétradas, incompletos fluorescentes, la forma más fácil de disminuir estos eventos no deseados simplemente monitoreando la cultura esporulación (Paso 3.3) y proceder una vez nuevos tétradas han dejado de formar. En nuestros experimentos, la frecuencia de díadas según es menos de 1%. En segundo lugar, para algunos cruces tiempo adicional en medio de esporulación a temperatura ambiente sin agitación (Paso 3.4) sigsignificativamente mejora la separación de tétradas por las perlas de vidrio durante chapado ((Protocolo Paso 6). De hecho, este paso es absolutamente necesario para la interrupción de algunos cruzamientos.
Al igual que todos los métodos de alto rendimiento, mejor es "ruidosa" que el enfoque convencional correspondiente. La modesta reducción en la eficiencia de BEST en comparación con la disección tétrada convencional podría ser el resultado de combinaciones de varios factores. Un factor es el aumento de la pérdida de esporas viables de otra manera, lo que podría resultar de la adhesión a las perlas de vidrio durante la extensión o aumento de la muerte de esporas debido a los esfuerzos mecánicos del proceso. Un segundo factor que podría ser simple pérdida de plásmido durante la meiosis. Un tercer factor podría ser una disminución efectiva en colonias utilizables resultantes de colonias con genotipos mixtos, se estima que ~ 5% de colonias en nuestro piloto cruza 1. Es probable que estas colonias representan fracasos de la hermana de separación de esporas. Debido a la rápida Fluorescence clasificación y separación de esporas permitir la recolección de un número enorme de tétradas, MEJOR está bien equipado para superar una disminución en la eficiencia en esta escala. Mientras que las versiones futuras de BEST podría aumentar la eficiencia próxima a la de la disección manual, que es tal vez más probable que la actual trayectoria exponencial de la capacidad de secuenciación de ADN compensará rápidamente para este nivel de pérdida de tensión utilizable. En cualquier caso, la capacidad de realizar análisis de tétrada en la escala a la que se puede aplicar mejor permitirá a los estudios que se encuentran actualmente inviable por métodos manuales.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por una concesión de NIH / NHGRI Genoma Académico / Facultad de Transición (K22 HG002908) de AMD y una asociación estratégica entre el Instituto de Biología de Sistemas y la Universidad de Luxemburgo. Las solicitudes de las cepas o plásmidos se deben dirigir a Aimée Dudley (aimee.dudley @ gmail.com).
FACSAria II (Special order unit) | BD Biosciences | – | Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto petri dishes (which may need |
Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II) | BD Biosciences | 643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument) | |
Zymolyase 100T | Seikagaku Biobusiness | ||
G418 | A.G. Scientific | http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html |