Barcode Enabled Sequencing di tetradi (BEST) sostituisce i processi manuali di isolamento, interrompendo e spaziatura tetradi. BEST isolati tetradi da cellule fluorescenza-attivato smistamento su piastre di agar, separa le spore mediante agitazione con perle di vetro, e determina che le colonie disposte in modo casuale sono stati ricavati dallo stesso tetrade originale utilizzando codici a barre molecolare.
Analisi Tetrad è uno strumento prezioso per la genetica del lievito, ma la natura manuale laborioso del processo ha ostacolato la sua applicazione su larga scala. Barcode Enabled Sequencing di tetradi (BEST) 1 sostituisce i processi manuali di isolamento, interrompendo e spaziatura tetradi. BEST isolati tetradi in virtù di una proteina di fusione GFP-specific sporulazione che consente fluorescenza-attivato cell sorting di tetradi direttamente su piastre di agar, dove l'asco è digerito enzimaticamente e le spore sono interrotti e in modo casuale schierati dalla placcatura di perle di vetro. Le colonie aploidi vengono poi assegnati i rapporti spore sorelle, vale a dire informazioni sulle spore originati dalla stessa tetrade, utilizzando i codici a barre molecolare letti durante la genotipizzazione. Eliminando il collo di bottiglia della dissezione manuale, centinaia o addirittura migliaia di tetradi possono essere isolati in pochi minuti. Qui vi presentiamo una descrizione dettagliata delle procedure sperimentali necessari per eseguire meglio nel lievitoSaccharomyces cerevisiae, a partire da un ceppo diploide eterozigote attraverso l'isolamento di colonie derivate dalla progenie meiotica aploide.
Mappatura genetica meiosi, comunemente noto come analisi tetrade, è fondamentale per la genetica del lievito. In breve, due ceppi aploidi, ognuna contenente una sola copia di ciascun cromosoma, sono abbinati a formare un ceppo diploide eterozigote con due copie di ciascun cromosoma, uno da ciascun genitore. Starving cellule diploidi per l'azoto induce meiosi (sporulazione), in cui i cromosomi duplicati, subiscono riarrangiamento, e si dividono in quattro cellule aploidi (spore o segreganti) con nuove combinazioni di alleli di ciascun genitore. Le quattro spore derivanti da una singola meiosi possono essere isolati da un processo manuale chiamato tetrade dissezione.
Tetrade convenzionale dissezione 2,3 che è cambiato relativamente poco dopo la pubblicazione originale nel 1937 4, ha tre obiettivi. In primo luogo, le cellule che hanno subito la meiosi (tetradi) devono essere isolati da uno sfondo di cellule vegetative. In analisi convenzionale, questo viene realizzato da un ricercatore che, utilizzandoun microscopio, identifica visivamente tetradi su una piastra di agar e impiega un apparato micromanipolatore identificare visivamente tetradi su una piastra di agar e utilizzando un micromanipolatore per spostare il tetrade su una zona senza cellula della piastra. Successivamente, i quattro spore della tetrade devono essere fisicamente separati per evitare interspore accoppiamento. Le spore all'interno di una tetrade sono tenuti insieme da entrambi un asco, il resto della parete cellulare della cellula diploide originale, e una serie di interspore ponti 5. Nell'analisi tetrade convenzionale asco viene rimosso mediante digestione enzimatica, e un ricercatore utilizza il micromanipolatore per rompere i ponti interspore e prendere in giro a parte le spore. Infine, le singole spore sono disposte in un modello a griglia che mantiene il rapporto tra le spore, cioè tutti progenie in una fila di quattro sono spore sorelle della stessa tetrade originale. Un ricercatore lievito esperto in grado di completare il processo di dissezione 10 tetradi (un numero minimo generalmente accettatoa croce) in circa 15 min.
Abbiamo sviluppato un nuovo metodo tetrade di genotipizzazione high-throughput, che noi chiamiamo B arcode E nabled S equencing di T etrads (BEST) 1. BEST amplia gli attuali metodi di genetica high-throughput, consentendo la generazione e la genotipizzazione di un gran numero di discendenti che sono isolate, di genotipi, e mantenute come individui in un modo che permette i rapporti spore sorelle di tutti e quattro i prodotti meiotiche da recuperare. Ciò avviene utilizzando tre strategie principali (Figura 1). Il primo è l'introduzione di un costrutto reporter di etichette che le cellule che hanno subito meiosi con GFP e permette loro di essere isolati da cellule fluorescenza-attivato (FACS). Seconda è l'incorporazione di un codice a barre DNA altamente complesso (una stringa di 15 nucleotidi casuali) in una forma che si trasmette a tutti e quattro spore di un tetrade e può essere letto dal sequenziamento del DNA ricombinante della Progeny, e quindi identifica spore sorelle dalla stessa tetrade. Terzo è il passo genotipizzazione, e migliore è compatibile con numerose piattaforme di genotipizzazione che catturano sia un set di marcatori genomici così come il codice a barre specifico tetrade. Impieghiamo un sito-associata DNA tag sequenziamento restrizione (RAD-seq) 6 metodo che dirige il sequenziamento del genoma di specifici siti di restrizione 1, catturando in tal modo un consistente 2-3% del genoma dei ceppi progenie così come il codice a barre plasmide-borne . Il recupero dei rapporti tetrade insieme ai dati di genotipizzazione empiricamente derivata dalla croce permette l'inferenza accurata delle informazioni mancanti, compreso lo stato di marcatori con bassa copertura sequenza e il genotipo completo di individui non vitali (e quindi non recuperabili). Qui, si descrive l'applicazione del metodo nel microrganismo più comunemente usato per la mappatura meiotica, il lievito S. cerevisiae. Tuttavia, con sostituzioni minori di rea-specifico organismosignori, ad esempio, diverse proteine specifiche per sporulazione fusi a GFP, il metodo dovrebbe essere facilmente trasferibile ad altri microrganismi, compresi gli organismi in cui la mappatura meiotic è significativamente più alta intensità di manodopera o attualmente intrattabile.
Figura 1. Metodo migliore. (A) Il plasmide pCL2_BC è un plasmide 2 micron con una fusione GFP-specific sporulazione, resistenza a G418, e un codice a barre casuale 15-mer. Costruzione del plasmide biblioteca è descritto in Ludlow et al 1. (B) Un pool di plasmidi barcode viene trasformato nel ceppo diploide da una croce. (C) trasformanti vengono poi coltivate su selezione e ~ 10.000 colonie trasformate sono raggruppati e sporulate. Durante la meiosi ogni spore di una tetrade eredita un copy del plasmide codice a barre. (D) tetradi sono separati dalle cellule unsporulated mediante FACS e raccolti su piastre di agar, dove vengono digeriti e interrotti per consentire a ciascun spore per formare una colonia. (E) Le colonie vengono poi raccolti in piastre a 96 pozzetti, caratterizzati fenotipicamente e genotipizzazione. Durante la genotipizzazione del codice a barre plasmide viene letto e utilizzato per identificare i quattro membri di ogni tetrade. Questa cifra è stata modificata da Ludlow et al 1. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Molti settori della ricerca genetica, che vanno dal carattere complesso di mappatura 11 per lo studio dei meccanismi sottostanti ricombinazione DNA 12, richiedono un numero estremamente elevato di progenie e alti volumi di sequenziamento del DNA. Tecniche che sposano il potere di approcci convenzionali con la capacità di high throughput sequenziamento del DNA hanno il potenziale per consentire studi che in precedenza erano intrattabile. Anche se molti high-throughput metodi di genetica del lievito sono stati applicati in modo efficace a problemi specifici, ognuno ha limitazioni che non raggiungono la vasta applicabilità dell'analisi tetrade convenzionale. I migliori indirizzi a queste sfide utilizzando un approccio high-throughput unisce tetrade dissezione e genotipizzazione la progenie di incroci di lievito. In concomitanza con multiplex RAD-tag sequenziamento, BEST offre un modo economico per raccogliere informazioni genotipo per ogni ceppo progenie mantenendo rapporti tetrade per mezzo di codici a barre tetrade unici.0; Di tutti attualmente utilizzato metodi di high throughput, BEST ricapitola più strettamente le informazioni fornite da una croce lievito sezionato manualmente.
BEST ha due caratteristiche principali. Il primo è l'uso del FACS per isolare rapidamente tetradi distanti unsporulated cellule in coltura (protocollo passaggi 5-6). La capacità di isolare migliaia di eventi fluorescenti (tetradi) dà BEST suo più grande guadagno in velocità. Questa automazione fornisce una ancora maggiore vantaggio rispetto dissezione manuale per incroci con bassa efficienza sporulazione, a causa del maggior tempo necessario per identificare visivamente eventi rari. La seconda caratteristica fondamentale è l'uso di un codice a barre molecolare molto complesso (Protocollo Fase 2) che viene trasmesso a ciascuna spora sorella di una tetrade. Poiché questi codici a barre possono essere utilizzati per computazionalmente ricostruire i rapporti tra tetrade spore che sono stati distribuiti a caso attraverso una piastra di agar, la necessità di manualmente celle di matrice in una griglia ordinata viene alleviata. Infine,perché il codice a barre molecolare e il gene reporter GFP-specific sporulazione sono fisicamente collegati (sullo stesso plasmide), solo tetradi che hanno mantenuto il codice a barre molecolare sono selezionati da FACS ordinamento.
Ci sono due considerazioni che governano il periodo di tempo che le colture devono essere incubate in mezzo di sporulazione. In primo luogo, perché il giornalista specifico sporulazione (SPS2-GFP) è espresso all'inizio del meiosi, da sola GFP non distingue completi tetradi 4 spore da cellule che non hanno completato la meiosi (cioè diadi). Mentre ulteriori gating FACS può diminuire il numero di fluorescenti, tetradi incomplete, il modo più semplice per ridurre questi eventi indesiderati è semplicemente monitorando la cultura sporulazione (punto 3.3) e procedere una volta nuovi tetradi hanno smesso di formatura. Nei nostri esperimenti, la frequenza delle diadi filtrate è inferiore all'1%. In secondo luogo, per qualche croci ulteriore tempo trascorso in mezzo sporulazione a RT senza agitazione (punto 3.4) segnalemigliora significativamente la separazione delle tetradi dalle perle di vetro durante la placcatura ((Protocollo Fase 6). Infatti, questa fase è assolutamente necessaria per la rottura di alcune croci.
Come tutti i metodi di high throughput, BEST è "rumoroso" di quanto l'approccio convenzionale corrispondente. La modesta riduzione di efficienza del BEST rispetto ai tradizionali tetrade dissezione potrebbe risultare dalla combinazione di diversi fattori. Un fattore è l'aumento della perdita di spore vitali in caso contrario, che potrebbero derivare da adesione alle perle di vetro durante la diffusione o aumentato di morte spore a causa delle sollecitazioni meccaniche del processo. Un secondo fattore potrebbe essere semplice perdita plasmide durante la meiosi. Un terzo fattore potrebbe essere un calo efficace in colonie utilizzabili derivanti da colonie con genotipi misti, si stima che circa il 5% delle colonie nel nostro pilota attraversa 1. È probabile che queste colonie rappresentano fallimenti di separazione spore sorella. Dato il rapido Fluorescence cernita e separazione spore consentire la raccolta di un numero enorme di tetradi, BEST è ben attrezzato per superare diminuzioni di efficienza su questa scala. Mentre future iterazioni di BEST potrebbe aumentare l'efficienza vicina a quella del dissezione manuale, è forse più probabile che l'attuale traiettoria esponenziale del DNA capacità sequenziamento sarà rapidamente compensare questo livello di perdita ceppo utilizzabile. Indipendentemente da ciò, la capacità di eseguire analisi tetrad sulla scala a cui può essere applicato BEST permetterà studi che sono attualmente irrealizzabile con metodi manuali.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato da un NIH / NHGRI Genome Scholar / Facoltà Transition Award (K22 HG002908) di AMD e un partenariato strategico tra l'Institute for Systems Biology e l'Università di Lussemburgo. Le richieste di ceppi o plasmidi devono essere indirizzate al Aimée Dudley (aimee.dudley @ gmail.com).
FACSAria II (Special order unit) | BD Biosciences | – | Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto petri dishes (which may need |
Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II) | BD Biosciences | 643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument) | |
Zymolyase 100T | Seikagaku Biobusiness | ||
G418 | A.G. Scientific | http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html |