Barcode Enabled Sequencing van Tetrads (BEST) vervangt de handmatige processen te isoleren, verstoren en spacing tetraden. BESTE isolaten tetrads door fluorescentie-geactiveerde celsortering op agarplaten, scheidt de sporen door roeren met glaskralen, en bepaalt welke willekeurig bekleed kolonies afgeleid van dezelfde oorspronkelijke viertal behulp van moleculaire barcodes.
Tetradenanalyse is een waardevol instrument voor gist genetica, maar de moeizame handmatige aard van het proces heeft de toepassing ervan belemmerd op grote schalen. Barcode Enabled Sequencing van Tetrads (BEST) 1 vervangt de handmatige processen te isoleren, verstoren en spacing tetraden. BESTE isolaten tetrads krachtens een sporulatie-specifiek GFP-fusie-eiwit dat fluorescentie-geactiveerde celsortering van tetrads maakt direct op agarplaten, waarbij de ascus enzymatisch gedigereerd en sporen worden verstoord en willekeurig bekleed met glasparels plateren. De haploïde kolonies worden vervolgens toegewezen zus spore relaties, dat wil zeggen informatie over welke sporen afkomstig uit hetzelfde viertal, met behulp van moleculaire barcodes lezen tijdens genotypering. Door het verwijderen van het knelpunt van handmatige dissectie, kunnen honderden of zelfs duizenden tetraden worden geïsoleerd in een paar minuten. Hier presenteren wij een gedetailleerde beschrijving van de experimentele procedures die de beste presteren in de gistSaccharomyces cerevisiae, te beginnen met een heterozygote diploïde stam door het isoleren van kolonies afgeleid van de haploïde meiotische nakomelingen.
Meiotische kaart brengen van genen, beter bekend als tetradenanalyse, staat centraal in gist genetica. In het kort, twee haploïde stammen, die elk een exemplaar van elk chromosoom, zijn gekoppeld aan een heterozygote diploïde stam vormen met twee exemplaren van elk chromosoom, een van elke ouder. Verhongeren diploïde cellen stikstof induceert meiose (sporulatie) waarin chromosoompakket ondergaan omlegging en in vier haploïde cellen (sporen of segreganten) met nieuwe combinaties van allelen van elke ouder. De vier sporen gevolg van een meiose kan worden geïsoleerd door een handmatig proces genaamd viertal dissectie.
Conventionele tetrad dissectie 2,3 die relatief weinig is veranderd sinds de oorspronkelijke publicatie in 1937 4, heeft drie doelen. Ten eerste moet cellen die meiose (tetrads) hebben ondergaan verwijderd worden geïsoleerd uit een achtergrond van vegetatieve cellen. In conventionele analyse, wordt dit bereikt door een onderzoeker die gebruikeen microscoop, identificeert visueel tetraden op een agar plaat en heeft een micromanipulator toestel visueel te identificeren tetraden op een agar plaat en met behulp van een micromanipulator om de tetrad verplaatsen naar een cel-vrij gebied van de plaat. Vervolgens moet de vier sporen in tetrad fysiek gescheiden interspore paring voorkomen. Sporen binnen een viertal worden bij elkaar gehouden door zowel een ascus, het overblijfsel van de celwand van de oorspronkelijke diploïde cel, en een set van interspore bruggen 5. In conventionele tetradenanalyse de ascus wordt verwijderd door enzymatische vertering, en een onderzoeker gebruikt de micromanipulator om de interspore bruggen te breken en plagen elkaar de sporen. Tenslotte worden de afzonderlijke sporen bekleed met een gerasterde patroon dat de relatie tussen de sporen stelt, dwz alle nakomelingen in een rij van vier zijn zuster sporen van hetzelfde origineel viertal. Een ervaren gist onderzoeker kan het proces van ontleden 10 tetraden (een algemeen aanvaarde minimum aantal rondenper kruis) in ongeveer 15 minuten.
We hebben een nieuwe high-throughput tetrad genotyperingsmethode, die noemen we B arcode E nabled S equencing van T etrads (BEST) 1 ontwikkeld. BEST breidt uit op de huidige methoden in high-throughput genetische doordat het genereren en genotypering van grote aantallen nakomelingen die geïsoleerd zijn, met genotypering en onderhouden als individuen op een wijze die het mogelijk maakt de zus spore relaties van alle vier meioseproducten te vorderen. Hierbij moeten drie strategieën (figuur 1). Eerst is de invoering van een reporter construct dat cellen die meiose ondergaan GFP labels mogelijk maakt die door fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) te isoleren. Ten tweede is de opname van een zeer complexe DNA barcode (een reeks van 15 willekeurige nucleotiden) in een vorm die voor alle vier sporen van een viertal wordt uitgezonden en kan worden gelezen door DNA sequentie van het recombinante Progeny en dus identificeert zuster sporen van dezelfde viertal. Derde is de genotypering stap, en het beste is compatibel met tal van genotypering platforms die geven zowel een set van genomische markers evenals het viertal specifieke barcode. We gebruiken een restrictieplaats geassocieerde DNA sequentie tag (RAD-seq) 6 methode genoom leidt tot specifieke restrictieplaatsen 1, waarbij het vastleggen van een consistente 2-3% van het genoom van de nakomelingen stammen en het plasmide-gedragen barcode . Het herstel van tetrad relaties samen met de empirisch-afgeleide genotypering gegevens van het kruis staat de juiste gevolgtrekking van ontbrekende informatie, met inbegrip van de status van markers met lage sequentie dekking en het volledige genotype van inviable (en dus onherstelbare) individuen. Hier, de toepassing van de werkwijze beschrijven we het meest gebruikte micro-organisme voor meiotische mapping, de gist S. cerevisiae. Echter, met geringe substituties van organisme-specifieke reaheren, bv. verschillende sporulatie-specifieke eiwitten gefuseerd met GFP, de methode moet gemakkelijk overdraagbaar naar andere micro-organismen, met inbegrip van organismen waarin meiotic mapping is aanzienlijk arbeidsintensiever of momenteel hardnekkig zijn.
Figuur 1. BEST methode. (A) De pCL2_BC plasmide is een 2-micron plasmide met een sporulatie-specifiek GFP fusie, weerstand tegen G418, en een 15-meer willekeurige barcode. Constructie van het plasmide bibliotheek wordt beschreven in Ludlow c.s. 1. (B) Een pool van barcodes plasmiden wordt omgezet in de diploïde stam uit een kruising. (C) transformanten worden vervolgens gekweekt op selectie en -10.000 getransformeerde kolonies samengevoegd en gesporuleerd. Tijdens de meiose elke spore van een viertal erft een copy van de barcode plasmide. (D) Tetrads worden uit unsporulated cellen gescheiden door FACS en verzameld op agarplaten, waar ze worden verteerd en verstoord dat elk spoor van een kolonie. (E) Kolonies worden vervolgens opgepikt in 96-well platen, fenotype en genotype. Tijdens genotyperen het plasmide barcode wordt gelezen en gebruikt om de vier leden van elk viertal te identificeren. Dit cijfer is gewijzigd van Ludlow et al. 1. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Vele gebieden van genetisch onderzoek, van complex kenmerk afbeelding 11 de studie van mechanismen DNA recombinatie 12, worden zeer grote aantallen nakomelingen en grote hoeveelheden DNA sequencing. Technieken die de kracht van de conventionele benaderingen met de capaciteit van high throughput DNA-sequencing trouwen hebben het potentieel om studies die eerder hardnekkige verkeerden. Hoewel verschillende high-throughput gistgenetica methoden effectief zijn toegepast op specifieke problemen, elk heeft beperkingen die niet aan de brede toepasbaarheid van conventionele tetradenanalyse vallen. BESTE adressen deze uitdagingen door het gebruik van een high-throughput aanpak waarbij tetrad dissectie en genotypering het nageslacht van gist kruisen. In combinatie met multiplex-RAD-tag sequencing, BEST biedt een goedkope manier om genotype informatie verzamelen voor elk nageslacht stam behoud tetrad relaties door middel van unieke tetrad barcodes.0; Van alle momenteel gebruikte high throughput methoden, BESTE nauwst recapituleert de door een handmatig ontleed gist kruis informatie.
BEST heeft twee belangrijke functies. De eerste is het gebruik van FACS snel isoleren tetraden afgelegen unsporulated cellen in de kweek (Protocol stappen 5-6). De mogelijkheid om duizenden fluorescerende evenementen (tetraden) isoleren geeft BESTE haar grootste winst van de overslag. Deze automatisering biedt een nog groter voordeel boven handmatige dissectie voor kruisingen met lage sporulatie rendement, vanwege de toegenomen tijd die nodig is om visueel zeldzame gebeurtenissen te identificeren. De tweede belangrijke kenmerk is het gebruik van een zeer complexe moleculaire barcode (Protocol Stap 2) dat voor iedere zuster spore van een viertal wordt verzonden. Omdat deze barcodes kunnen worden gebruikt om computationeel reconstrueren viertal relaties tussen sporen die willekeurig zijn verdeeld over een agarplaat, de noodzaak om handmatig reeks cellen in een geordende rooster verlicht. Tenslotteomdat de moleculaire streepjescode en sporulatie-specifiek GFP reportergen fysiek verbonden (op hetzelfde plasmide) worden alleen tetrads dat de moleculaire streepjescode hebben behouden geselecteerd door FACS-sortering.
Er zijn twee overwegingen die de tijdsduur dat culturen in de sporulatie medium worden geïncubeerd regelen. Ten eerste, omdat de sporulatie specifieke reporter (SPS2-GFP) in het begin van meiose wordt uitgedrukt, GFP alleen niet compleet 4-spore tetraden onderscheiden van cellen die niet hebben voltooid meiose (dwz tweetallen). Terwijl de extra FACS gating het aantal fluorescerende, onvolledige tetraden kan afnemen, is de gemakkelijkste manier om deze ongewenste gebeurtenissen verlagen gewoon toezicht op de sporulatie cultuur (Stap 3.3) en over te gaan zodra nieuwe tetraden zijn gestopt vormen. In onze experimenten de frequentie van tweetallen gesorteerd minder dan 1%. Ten tweede, voor sommige kruisen extra tijd doorgebracht in sporulatie medium bij kamertemperatuur zonder agitatie (Stap 3.4) significantly verbetert de scheiding van tetrads door de glasparels gedurende plating ((Protocol stap 6). In feite is deze stap absoluut noodzakelijk om verstoring van sommige kruisen.
Zoals alle high throughput methoden, BEST is "luidruchtiger" dan de overeenkomstige conventionele benadering. De bescheiden vermindering van de efficiëntie van BEST vergeleken met conventionele tetrad dissectie zou kunnen voortvloeien uit een combinatie van verschillende factoren. Een factor is de toegenomen verlies van overigens gezonde sporen, die kan voortvloeien uit hechting aan de glasparels tijdens verspreiding en verhoogde spore overlijden als gevolg van de mechanische belasting van het proces. Een tweede factor kan eenvoudig plasmide verlies tijdens de meiose. Een derde factor kan een effectieve daling van de bruikbare kolonies als gevolg van kolonies met gemengde genotypes zijn, naar schatting ~ 5% van de kolonies in onze piloot kruist 1. Het is waarschijnlijk dat deze kolonies vertegenwoordigen mislukkingen van zus spore scheiding. Omdat de snelle fluorEscence sorteren en spore scheiding toestaan dat de verzameling van enorme aantallen tetraden, is het best goed uitgerust om dalingen in efficiëntie op deze schaal te overwinnen. Terwijl toekomstige herhalingen van BEST efficiëntie kunnen verhogen naderen die van handmatige dissectie, is het misschien meer waarschijnlijk dat de huidige exponentiële traject van DNA-sequencing capaciteit snel zal compenseren voor dit niveau van bruikbare spanning verlies. Desondanks zullen de mogelijkheid tetradenanalyse voeren op de schaal die het best kan worden toegepast studies die momenteel haalbaar door handmatige methoden mogelijk.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door een NIH / NHGRI Genome Scholar / Faculty Transition Award (K22 HG002908) aan AMD en een strategisch partnerschap tussen het Institute for Systems Biology en de Universiteit van Luxemburg. Verzoeken om stammen of plasmiden moeten worden gericht aan Aimee Dudley (aimee.dudley @ gmail.com).
FACSAria II (Special order unit) | BD Biosciences | – | Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto petri dishes (which may need |
Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II) | BD Biosciences | 643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument) | |
Zymolyase 100T | Seikagaku Biobusiness | ||
G418 | A.G. Scientific | http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html |