רצף ברקוד מופעל של Tetrads (הטובים ביותר) מחליף את התהליכים ידניים של בידוד, שיבוש ומרווח tetrads. BEST מבודד tetrads ידי תא הקרינה המופעל מיון על גבי צלחות אגר, מפריד את הנבגים על ידי תסיסה עם חרוזי זכוכית, וקובע שמושבות ערוכות באופן אקראי נגזרו מאותו הטטרדה המקורי באמצעות ברקודים מולקולריים.
ניתוח הטטרדה הוא כלי רב ערך עבור שמרי גנטיקה, אבל טבע מדריך למייגע של התהליך יש הפריע יישומה בקנה מידה גדולה. ברקוד מופעל רצף של Tetrads (הטובים ביותר) 1 מחליף את התהליכים ידניים של בידוד, שיבוש ומרווח tetrads. BEST מבודד tetrads מכוחו של חלבון ה-GFP היתוך נביגה ספציפית המאפשר מיון תא הקרינה המופעל של tetrads ישירות על גבי צלחות אגר, שבו הנאד מתעכל enzymatically והנבגים הם שיבשו באופן אקראי וערוך על ידי ציפוי חרוז זכוכית. המושבות הפלואידים מכן הוקצו יחסי נבג אחות, כלומר מידע על שנבגי מקורו מאותו הטטרדה, באמצעות ברקודים מולקולריים לקרוא בגנוטיפ. על ידי הסרת את צוואר הבקבוק של נתיחה ידנית, ניתן לבודד מאות או אפילו אלפי tetrads בתוך דקות. כאן אנו מציגים תיאור מפורט של הפרוצדורות הנדרשות לביצוע הטובים ביותר בשמריםשמר אפייה, החל במתח דיפלואידי הטרוזיגוטיים דרך הבידוד של מושבות נגזרות מצאצאי meiotic הפלואידים.
מיפוי Meiotic גן, הידוע בכינויו ניתוח הטטרדה, הוא מרכזי לשמרי גנטיקה. בקצרה, שני זנים הפלואידים, המכילים עותק אחד של כל כרומוזום, הם הזדווגו כדי ליצור מתח דיפלואידי הטרוזיגוטיים עם שני עותקים של כל כרומוזום, אחד מכל הורה. הרעבת תאי דיפלואידי לחנקן גורמת למיוזה (נביגה) שבו הכרומוזומים לשכפל, לעבור ארגון מחדש, ומתחלקים לארבעה תאים הפלואידים (נבגים או segregants) עם צירופים חדשים של אללים מכל הורה. ארבעה נבגים הנובעים ממיוזה יחידה יכולים להיות מבודדים על ידי תהליך ידני שנקרא נתיחת הטטרדה.
2,3 הנתיחה הקונבנציונלי הטטרדה שהשתנה מעט יחסית מאז הפרסום המקורי בשנת 1937 4, יש שלוש מטרות. ראשית, תאים שעברו מיוזה (tetrads) חייבים להיות מבודדים מרקע של תאי צמח. בניתוח קונבנציונלי, זה נעשה על ידי חוקר ש, באמצעותמיקרוסקופ, מבחינה ויזואלית מזהה tetrads על צלחת אגר ומעסיק מנגנון micromanipulator חזותי זיהוי tetrads על צלחת אגר ובאמצעות micromanipulator לעבור הטטרדה על אזור ללא תא של הצלחת. בשלב הבא, ארבעת הנבגים בהטטרדה חייבים להיות מופרדים פיזי כדי למנוע הזדווגות interspore. נבגים בתוך הטטרדה מוחזקים יחד על ידי שני נאד, השריד של קיר התא של תא דיפלואידי המקורי, וקבוצה של interspore גשרים 5. בניתוח קונבנציונלי הטטרדה הנאד יוסר על ידי עיכול אנזימטי, וחוקר משתמש micromanipulator לשבור גשרי interspore ולהקניט בנפרד הנבגים. לבסוף, הנבגים הבודדים אינם ערוכים בדפוס gridded ששומר על היחסים בין הנבגים, כלומר כל הצאצאים בשורה של ארבעה הם נבגי אחותו של אותו הטטרדה מקורי. שמרי חוקר מנוסה יכול להשלים את התהליך של ביתור 10 tetrads (מספר מינימאלי מקובללצלב) בכ 15 דקות.
פיתחנו שיטה חדשה תפוקה גבוהה גנוטיפ הטטרדה, שאנו מכנים E arcode B equencing S nabled של etrads T (הטובים ביותר) 1. BEST מרחיב על שיטות קיימים בגנטיקה תפוקה גבוהה כך שהיא מאפשרת את הדור וגנוטיפ של מספרים גדולים של צאצאים כי הם מבודדים, genotyped, ונשמר כיחידים באופן שמאפשר יחסי נבג אחותו של כל ארבעת מוצרי meiotic להיות התאוששו. המטרה זו מושגת על ידי שימוש בשלוש אסטרטגיות עיקריות (איור 1). הראשון הוא המבוא של כתב לבנות כי תוויות בתאים שעברו מיוזה עם GFP ומאפשר להם להיות מבודדים על ידי תא הקרינה המופעל מיון (FACS). שני הוא השילוב של ברקוד DNA המורכב ביותר (מחרוזת של 15 נוקלאוטידים אקראיים) בטופס המועבר לכל ארבעת הנבגים של הטטרדה וניתן לקרוא על ידי רצפי DNA של ProGen רקומביננטיy ובכך מזהה את נבגי אחות מאותו הטטרדה. שלישי הוא צעד גנוטיפ, והטוב ביותר הוא תואם עם פלטפורמות גנוטיפ רבות שהלכידה שני סט של סמנים הגנומי כמו גם ברקוד הטטרדה ספציפי. אנו מעסיקים רצף הגבלה הקשורים אתר DNA תג (RAD-seq) שיטה 6 שמנתב את רצף הגנום לאתרי הגבלה ספציפי 1, ובכך ללכוד 2-3% עקביים של הגנום של זני צאצאים, כמו גם את הברקוד שמקורן בפלסמיד . ההתאוששות של מערכות יחסים הטטרדה יחד עם נתונים גנוטיפ אמפירי הנגזרים מן הצלב מאפשרת היסק מדויק של מידע חסר, ובכלל זה מעמדם של סמנים עם כיסוי רצף נמוך והגנוטיפ של אנשים inviable (ולכן בלתי הפיך) המלא. כאן, אנו מתארים את יישום השיטה במיקרואורגניזם הנפוץ ביותר המשמש למיפוי meiotic, שמרי ס cerevisiae. עם זאת, עם החלפות של קטין ריאה האורגניזם ספציפירבותיי, למשל חלבונים נביגה ספציפית שונים התמזגו ה-GFP, השיטה צריכה להיות בקלות להעברה למיקרואורגניזמים אחרים, כוללים אורגניזמים שבו מיפוי meiotic הוא באופן משמעותי יותר עבודה אינטנסיבית או פתירה ברגע זה.
איור 1. השיטה הטובים ביותר. () פלסמיד pCL2_BC הוא פלסמיד 2 מיקרון עם פיוז'ן נביגה ספציפי GFP, התנגדות לG418, וברקוד אקראי 15 mer. בנייה של ספריית פלסמיד מתוארת באל Ludlow et 1. (ב) בריכה של פלסמידים המינימרקטים הופכת לזן דיפלואידי מצלב. אז transformants (C) גדלים על בחירה ו~ 10,000 מושבות הפכו הם אספו וsporulated. במהלך המיוזה כל נבג של הטטרדה יורש שיתוףpy של פלסמיד המינימרקטים. Tetrads (ד ') מופרדים מתאי unsporulated ידי FACS ונאסף על צלחות אגר, שם הם מתעכלים ושבשו כדי לאפשר לכל נבג להקים מושבה. לאחר מכן מושבות (E) נאספות לתוך צלחות 96 היטב, phenotyped, וgenotyped. במהלך genotyping רקוד פלסמיד הוא לקרוא ומשמש לזיהוי ארבעה החברים של כל הטטרדה. נתון זה שונה מאל Ludlow et 1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
תחומים רבים של מחקר בגנטיקה, החל מיפוי תכונה מורכב 11 לחקר מנגנוני רקומבינציה DNA 12, דורשים מספרים גדולים מאוד של צאצאים וכמויות גדולים של רצפי DNA. יש טכניקות שתינשאנה את כוחו של גישות קונבנציונליות עם הקיבולת של רצפי DNA תפוקה גבוהה הפוטנציאל לאפשר מחקרים שהיו בלתי פתירים בעבר. למרות מספר שיטות שמרי גנטיקה תפוקה גבוהה יושמו בצורה יעילה לבעיות ספציפיות, לכל אחד יש מגבלות שנופלות מתחולתה הרחבה של ניתוח הטטרדה קונבנציונלי. הכתובות הטובים ביותר עם אתגרים אלה על ידי העסקת גישת תפוקה גבוהה המשלבת נתיחת הטטרדה וgenotyping הצאצאים של שמרי צלבים. בשיתוף עם רצף RAD-תג מרובב, BEST מציע דרך זולה כדי ללקט מידע גנוטיפ עבור כל זן צאצאים תוך שמירה על יחסי הטטרדה באמצעות ברקודים הטטרדה ייחודיים.0; של שימוש בכל שיטות כיום תפוקה גבוהות, BEST משחזר באופן הדוק ביותר את המידע המסופק על ידי שמרי צלב גזור באופן ידני.
יש BEST שתי תכונות עיקריות. הראשון הוא השימוש בFACS לבודד tetrads במהירות הרחק מתאים unsporulated בתרבות (פרוטוקול שלבי 5-6). היכולת לבודד אלפי אירועי ניאון (tetrads) נותנת BEST הרווח הגדול ביותר שלה בתפוקה. אוטומציה זה מספקת יתרון גדול עוד יותר מעל לנתיחה במדריך לצלבים עם יעילות נביגה נמוכה, בשל הזמן עלה צורך לזיהוי חזותי של אירועים נדירים. תכונת המפתח השנייה היא השימוש ברקוד מורכב ביותר מולקולרי (פרוטוקול שלב 2) שמועבר לכל נבג אחותו של הטטרדה. מכיוון שניתן להשתמש בם ברקודים אלה למחשוב לשחזר את יחסי הטטרדה בין הנבגים שהופצו באופן אקראי על פני צלחת אגר, הצורך באופן ידני תאי מערך ברשת הורה הוא להקל עליו. לבסוף,כי את הברקוד המולקולרי וגן כתב ה-GFP נביגה ספציפית מקושרים פיזי (באותו פלסמיד), רק tetrads ששמר את הברקוד המולקולרי נבחרים על ידי FACS מיון.
ישנם שני שיקולים הקובעים את משך הזמן שתרבויות צריכה להיות מודגרות במדיום נביגה. ראשית, משום שהכתב נביגה הספציפי (SPS2-GFP) בא לידי הביטוי בשלב מוקדם במיוזה, GFP לבד אינו מבחין tetrads 4 נבג-שלם מהתאים שעדיין לא סיימו את המיוזה (כלומר צמדים). בעוד gating FACS נוסף עשוי להקטין את מספר tetrads ניאון, לא שלם, הדרך הקלה ביותר כדי להקטין את האירועים הללו לא רצויים היא פשוט ניטור התרבות נביגה (שלב 3.3) ושתמשיך פעם tetrads החדש הפסיק יוצרים. בניסויים שלנו, בתדירות של צמדים מסודרים היא פחות מ -1%. שנית, לכמה זמן נוסף צלבים בילה במדיום נביגה ב RT ללא תסיסה (שלב 3.4) significantly משפרת את ההפרדה tetrads ידי חרוזי הזכוכית בציפוי ((שלב פרוטוקול 6). למעשה, צעד זה הוא הכרחי לשיבוש של כמה צלבים.
כמו כל שיטות התפוקה גבוהות, הטובים ביותר הוא "רועש" מאשר הגישה הקונבנציונלית המקבילה. הירידה הקלה ביעילות הטובים ביותר בהשוואה לנתיחה הטטרדה קונבנציונלית יכולה לנבוע משילוב של מספר גורמים. גורם אחד הוא האובדן המוגבר של נבגי קיימא אחר, אשר עלול להיגרם כתוצאה מהידבקות לחרוזי הזכוכית בהפצה או מוגבר מות נבג בשל הלחצים מכאניים של התהליך. גורם שני יכול להיות אובדן פלסמיד פשוט במהלך המיוזה. גורם שלישי יכול להיות ירידה יעילה במושבות שמישה וכתוצאה ממושבות מעורבים גנוטיפים, 5% ~ משוער של מושבות בפיילוט שלנו חוצים 1. סביר להניח כי מושבות אלה מייצגים כישלונות של הפרדה נבג אחות. בגלל פלואוריד המהירescence מיון והפרדת נבג לאפשר האוסף של מספרים עצומים של tetrads, הטובים ביותר הוא מצויד היטב כדי להתגבר על ירידה ביעילות בקנה מידה זה. בעוד חזרות עתידיות של BEST יכולים להגביר את היעילות מתקרבות לזה של נתיחה ידנית, זה אולי סביר יותר להניח כי מסלול מעריכי הנוכחי של קיבולת רצפי DNA יהיה במהירות לפצות על זה ברמה של אובדן מתח שמיש. בכל מקרה, את היכולת לבצע ניתוח הטטרדה בקנה המידה שבה ניתן ליישם BEST תאפשר מחקרים כי כרגע בלתי אפשריים בשיטות ידניות.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על הגנום Scholar / פקולטה מעבר פרס NIH / NHGRI (K22 HG002908) ל-AMD ושותפות אסטרטגית בין המכון למערכות ביולוגיה והאוניברסיטה של לוקסמבורג על ידי. בקשות לזנים או פלסמידים צריכים להיות מופנות לאיימו דאדלי (aimee.dudley @ gmail.com).
FACSAria II (Special order unit) | BD Biosciences | – | Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto petri dishes (which may need |
Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II) | BD Biosciences | 643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument) | |
Zymolyase 100T | Seikagaku Biobusiness | ||
G418 | A.G. Scientific | http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html |