Tetrads의 바코드 사용 시퀀싱 (BEST)를 분리 방해 및 tetrads 간격의 수동 프로세스를 대체합니다. BEST는 한천 플레이트에 정렬 형광 활성화 된 셀에 의해 tetrads를 격리 유리 구슬로 교반하여 포자를 분리하고, 무작위로 배열 된 식민지는 분자 바코드를 사용하여 동일한 원본 테트라에서 파생 된 결정합니다.
테트라 분석은 효모 유전학을위한 유용한 도구입니다,하지만 프로세스의 힘든 수동 성격은 큰 규모에 해당 응용 프로그램을 방해하고있다. 바코드 Tetrads의 시퀀싱 (BEST) 1, 분리 방해 및 tetrads 간격의 수동 프로세스를 대체 할 수있었습니다. BEST 직접 자낭이 효소 소화하고 포자가 중단되고, 무작위로 유리 구슬 도금에 의해 배열 한천 플레이트에 tetrads의 형광 활성화 된 셀 정렬을 허용하는 포자 특정 GFP 융합 단백질의 미덕으로 tetrads을 분리합니다. 포자 유전자형 동안 읽을 분자 바코드를 사용하여 동일한 테트라에서 유래, 즉 정보를하는지에 대한 반수체 식민지 다음, 자매 포자 관계가 할당됩니다. 수동 해부의 병목 현상을 제거함으로써, tetrads의 수백 또는 수천 분에 격리 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 효모에 최선을 수행하는 데 필요한 실험 절차에 대한 자세한 설명을 제공사카로 마이 세스 세레 비시 애, 반수체 감수 자손에서 파생 된 식민지의 분리를 통해 이형 이배체 변형으로 시작.
일반적으로가 원소 분석으로 알려진 감수 유전자 매핑, 효모 유전학의 중심이다. 간단히, 각 각 염색체의 단일 복사본을 포함하는 두 개의 반수체 균주, 각 염색체의 두 개의 사본, 각 부모로부터 하나 이형 이배체 긴장을 형성하기 위해 결합됩니다. 질소 이배체 세포를 굶주리는 것은 염색체 복제, 재 배열을 받아야하고, 각각의 부모로부터 대립 유전자의 새로운 조합으로 네 개의 반수체 세포 (포자 또는 segregants)로 나누어 (포자)하는 감수 분열을 유도한다. 단일 감수 분열로 인한 사 포자 테트라 박리라는 수동 프로세스에 의해 단리 될 수있다.
1937 4에 해당 출판물 때문에 상대적으로 조금 변경되었습니다 기존 테트라 해부 2,3 세 가지 목표를 가지고 있습니다. 첫째, 감수 분열 (tetrads)을받은 세포는 식물 세포의 배경에서 멀리 격리해야합니다. 기존의 분석에서, 이것은 사용하는 사람의 연구원에 의해 수행된다현미경은 시각적으로 agar 접시에 tetrads을 식별하고 미세 조작기 장치는 시각적으로 agar 접시에 tetrads을 식별하고 플레이트의 세포가없는 지역에 테트라를 이동하는 미세 조작기를 이용하여 사용합니다. 다음으로, 테트라에서 4 개의 포자는 물리적으로 interspore 연결을 방지하기 위해 구분해야합니다. 테트라 내에서 포자는 자낭, 원래 배체 세포의 세포벽의 남은 및 interspore 교량 5 세트 모두 함께 개최된다. 기존 테트라 분석에서 자낭은 소화 효소에 의해 제거하고, 연구원은 interspore 교량을 파괴하고 포자를 떨어져 애타게 미세 조작기를 사용합니다. 마지막으로, 개개의 포자는 포자의 관계를 유지 그리드 화 패턴으로 배열되어, 네 개의 행 즉, 모든 자손은 동일한 일본어 테트라 여동생 포자이다. 경험이 풍부한 효모 연구원은 10 tetrads (일반적으로 허용되는 최소 수를 해부하는 과정을 완료 할 수 있습니다약 15 분에) 간 당.
우리는 우리가 1 (BEST) T의 etrads의 nabled S의 equencing B의 arcode의 E 전화를 새로운 높은 처리량가 원소의 유전자형 방법을 개발했습니다. BEST는 절연되어 자손 많은 수의 유전자형, 그리고 네 감수 제품의 자매 포자의 관계를 복구 할 수 있도록하는 방식으로 개인과 유지의 생성 및 유전자형을 가능하게하여 높은 처리량 유전학 현재의 방법에 따라 확장합니다. 이 세 가지 주요 전략 (그림 1)를 사용하여 수행됩니다. 첫 번째는 GFP와 세포의 감수 분열을받은 셀 라벨과 그들이 (FACS)를 정렬 형광 활성화 된 셀에 의해 분리 할 수 기자 구문의 소개입니다. 제가 원소의 네 포자에 송신하고 Progen는 재조합 DNA의 염기 서열에 의해 판독 될 수있는 형태로 매우 복잡한 DNA 바코드의 내장 (15 무작위 뉴클레오티드 문자열)이며따라서 Y와 같은 테트라에서 자매 포자를 식별합니다. 세 번째는 유전자형 단계이며, BEST 포착하는 게놈 마커 세트뿐만 아니라 테트라 특정 바코드를 모두 다수의 유전자형 플랫폼과 호환됩니다. 우리는 이에 일관된 2-3 자손 균주의 게놈의 %뿐만 아니라 캡처, 제한 사이트 관련 DNA 태그 시퀀싱 (RAD-서열) 특정 제한 사이트 1 게놈 시퀀싱을 지시 6 방법을 사용 플라스미드 매개 바코드 . 십자가에서 경험적으로 파생 된 유전자형 데이터와 함께 테트라 관계의 회복은 낮은 순서의 범위와 마커의 상태와 inviable (따라서 복구 할 수없는) 개인의 전체 유전자형을 포함하여 누락 된 정보의 정확한 추론을 할 수 있습니다. 여기서, 우리는 감수 매핑을 위해 가장 일반적으로 사용되는 미생물, 효모 S.보기에서 방법의 응용을 설명 사카로 마이 세스 세레 비시 애. 그러나 유기체 특정 정말이에요의 사소한 대체와신사는, GFP 융합 예를 들어, 다른 포자 특정 단백질이 방법은 감수 매핑이 집중 또는 현재 어려운 훨씬 더 노동하는 생물 등 다른 미생물에 쉽게 양도해야한다.
그림 1. 가장 좋은 방법. (A) pCL2_BC 플라스미드는 포자 특정 GFP 융합, G418에 대한 저항, 그리고 15 메르 임의의 바코드와 함께 2 마이크론 플라스미드이다. 플라스미드 라이브러리의 건설은 러들로 등의 알 1에 설명되어 있습니다. (B) 바코드 플라스미드의 풀은 십자가에서 이배체 균주로 변환됩니다. (C) 형질 전환 한 다음 선택에서 재배되고 ~ 10,000 변형 식민지 풀링 및 포자됩니다. 감수 분열시가 원소의 각 포자가 공동 상속바코드 플라스미드의 평. (D) Tetrads는 FACS로 unsporulated 세포를 분리하고 소화 각 포자가 식민지를 형성 할 수 있도록 중단되는 한천 플레이트에 수집됩니다. (E) 콜로니는 그 다음 96 웰 플레이트에 고른 phenotyped 및 유전자형된다. 유전형 동안 플라스미드 바코드 판독하고 각각의 테트라 개의 멤버를 식별하기 위해 사용된다. 이 그림은 러들 외 여러분 1에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
복잡한 특성 매핑 (11)로부터 DNA 재조합 (12)를 기본 메커니즘의 연구에 이르기까지 유전학 연구의 많은 지역은 자손의 매우 큰 숫자와 DNA 염기 서열의 높은 볼륨을 필요로합니다. 높은 처리량의 DNA 시퀀싱의 용량을 기존의 접근 방식의 힘 결혼 기술 이전에 다루기 힘든이었다 연구를 가능하게 할 가능성이있다. 여러 높은 처리량 효모 유전학 방법은 특정 문제에 효과적으로 적용되어 있지만, 각각의 기존 테트라 분석의 광범위한 응용에 미치지 제한 사항이 있습니다. 테트라 해부를 결합 높은 처리량 접근 방식을 채택하고 효모 십자가의 자손 유전형에 의한 BEST 주소 이러한 과제. 멀티 플렉스 RAD 태그의 순서와 함께, BEST 고유 테트라 바코드에 의해 테트라 관계를 유지하면서 각각의 자손 균주의 유전자형 정보를 수집합니다하는 저렴한 방법을 제공합니다.0; 모든 현재 높은 처리 방법을 사용 BEST 가장 가깝게 수동 해부 효모 교차에 의해 제공된 정보가 되풀이되었습니다.
BEST는 두 가지 주요 기능을 가지고 있습니다. 첫 번째는 빠르게 (프로토콜 5-6 단계) 거리 문화 unsporulated 세포 tetrads을 분리하는 FACS를 사용하는 것입니다. 형광 이벤트 (tetrads)의 수천을 분리 할 수있는 능력은 BEST에게 처리량이 가장 큰 이득을 제공합니다. 이 자동화로 인해 시각적으로 희귀 한 이벤트를 식별하는 데 필요한 시간이 증가로, 낮은 포자 효율 십자가 수동 해부를 통해 더 큰 이점을 제공한다. 두 번째 중요한 특징은 테트라 각각 자매 포자로 송신된다 고도로 복잡한 분자 바코드 (프로토콜 단계 2)의 사용이다. 이러한 바코드는 무작위 필요성 수동 정렬 격자의 배열 셀이 완화되는, 한천 플레이트에 분산 된 테트라 드 포자 간의 관계를 재구성 계산하는데 사용될 수 있기 때문이다. 마지막으로,분자 바코드와 포자 특정 GFP 리포터 유전자가 물리적으로 (같은 플라스미드에) 연결되어 있기 때문에, 분자 바코드를 유지 만 tetrads는 FACS 정렬에 의해 선택된다.
문화 포자 매체에 배양해야하는 시간을 제어하는 두 가지 고려 사항이 있습니다. 포자 특정 기자 (SPS2-GFP)이 초기의 감수 분열로 표현되기 때문에 첫째, 혼자 GFP는 감수 분열 (즉, 산모와 아기를) 완료하지 않은 세포에서 완전한 4 – 포자 tetrads를 구분하지 않습니다. 추가 FACS 게이팅 형광, 불완전 tetrads의 수를 줄일 수 있지만, 원치 않는 사건을 줄일 수있는 가장 쉬운 방법은 단순히 포자 문화를 모니터링 (3.3 단계) 한 번 새로운 tetrads 형성 중지 진행되고있다. 우리의 실험에서는, 우선 댓구의 빈도는 1 % 미만이다. 둘째, 동요하지 않고 실온에서 포자 형성 매체에서 보낸 일부 십자가 추가 시간에 시그 (3.4 단계)촉진 시켜서 사실,이 단계는 약간의 십자가의 중단을 위해 절대적으로 필요하다 도금 동안 유리 구슬로 tetrads의 분리 ((프로토콜 6 단계). 향상시킵니다.
모두 높은 처리량 방법과 마찬가지로, BEST는 대응하는 기존의 방법보다 "시끄럽다"입니다. 기존 테트라 절제술에 비해 최고 효율의 겸손한 감소는 여러 가지 요인의 조합에서 발생할 수 있습니다. 한 가지 요인으로 인해 공정의 기계적 스트레스에 포자 사멸을 확산하거나 증가하는 동안 유리 비드의 접착에서 발생할 수있는, 달리 실행 가능한 포자의 증가 된 손실이다. 두 번째 요인은 세포의 감수 분열시 간단한 플라스미드 손실 될 수 있습니다. 세 번째 요인은 혼합 유전자형을 가진 식민지에서 발생 가능한 식민지에서 효과적인 감소 될 수있다, 우리의 파일럿 식민지의 추정 ~ 5 % 1을 교차. 이들 식민지 자매 포자 분리의 실패를 나타내는 것으로 보인다. 때문에 빠른 불소escence 정렬 및 포자 분리 tetrads 엄청난 숫자의 컬렉션을 허용, BEST는 잘 규모의 효율 감소를 극복하기 위해 장착되어 있습니다. BEST 미래의 반복 수동 절개의 접근 효율성을 증가시킬 수 있지만, 그것은 DNA 시퀀싱 용량의 현재 지수 궤적이 빠르게 사용할 변형 손실이 수준을 보상 할 것을 아마 가능성이 높습니다. 어쨌든, BEST는 적용 할 수있는 규모가 원소 분석을 수행 할 수있는 능력은 현재 설명서의 방법에 의해 실행할 수 없게되어 연구를 가능하게 할 것이다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 AMD에 대한 NIH / NHGRI 게놈 학술 / 학부 전환 수상 (K22 HG002908) 및 시스템 생물학 연구소와 룩셈부르크의 대학 간의 전략적 제휴에 의해 지원되었다. 변종 또는 플라스미드에 대한 요청은 아미 더들리 (aimee.dudley @ gmail.com)로 지정해야합니다.
FACSAria II (Special order unit) | BD Biosciences | – | Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto petri dishes (which may need |
Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II) | BD Biosciences | 643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument) | |
Zymolyase 100T | Seikagaku Biobusiness | ||
G418 | A.G. Scientific | http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html |