الباركود تمكين تسلسل Tetrads (بست) يحل محل العمليات اليدوية لعزل وتعطيل وتباعد tetrads. أفضل يعزل tetrads من قبل الخلية مضان تنشيط الفرز على لوحات أجار، يفصل الجراثيم عن طريق التحريض مع الخرز الزجاجي، ويحدد التي تستمد المستعمرات المحتشدة عشوائيا من نفس الرباعيات الأصلي باستخدام الباركود الجزيئية.
تحليل الرباعيات هو أداة قيمة لعلم الوراثة الخميرة، ولكن طبيعة دليل شاقة عملية أعاق تطبيقها على المقاييس الكبيرة. الباركود تمكين تسلسل Tetrads (بست) 1 يحل محل العمليات اليدوية لعزل وتعطيل وتباعد tetrads. أفضل يعزل tetrads بحكم بروتين GFP الانصهار تبوغ محددة تسمح مضان تنشيط الخلايا الفرز من tetrads مباشرة على لوحات أجار، حيث يتم هضم إنزيمي زق وتتعطل الجراثيم وبشكل عشوائي من قبل المحتشدة الزجاج والطلاء حبة. ثم يتم تعيين المستعمرات فرداني العلاقات بوغ أخت، أي معلومات حول أي جراثيم نشأت من نفس الرباعيات، وذلك باستخدام الباركود الجزيئية قراءة خلال التنميط الجيني. عن طريق إزالة عنق الزجاجة للتشريح دليل، أو حتى مئات الآلاف من tetrads يمكن أن تكون معزولة في غضون دقائق. نحن هنا تقديم وصف تفصيلي للإجراءات التجريبية المطلوبة لأداء أفضل في الخميرةخميرة الخباز، بدءا من سلالة مضاعفا متخالف من خلال عزل المستعمرات المستمدة من ذرية الانتصافي فرداني.
رسم خرائط الجينات الانتصافي، والمعروف باسم تحليل الرباعيات، أمر أساسي لعلم الوراثة الخميرة. لفترة وجيزة، وتزاوج سلالتين فرداني، تحتوي كل منها على نسخة واحدة من كل كروموسوم، لتشكيل سلالة مضاعفا متخالف مع نسختين من كل كروموسوم، واحد من كل من الوالدين. تجويع الخلايا مضاعفا للنيتروجين يؤدي الانقسام الاختزالي (تبوغ) التي الكروموسومات مكررة، الخضوع لإعادة ترتيب، وتقسيمها إلى أربع خلايا فرداني (جراثيم أو segregants) مع مجموعات جديدة من الأليلات من كل من الوالدين. الجراثيم أربعة الناتجة عن الانقسام الاختزالي واحدة يمكن أن تكون معزولة عن طريق عملية يدوية دعا تشريح الرباعيات.
التقليدية الرباعيات تشريح 2،3 التي قد تغير قليلا نسبيا منذ نشر الأصلي في عام 1937 4، لديه ثلاثة أهداف. الأولى، والخلايا التي خضعت الانقسام الاختزالي (tetrads) يجب أن تكون معزولة بعيدا عن خلفية من الخلايا النباتية. في التحليل التقليدي، ويتم ذلك من قبل الباحث الذي، وذلك باستخدامالمجهر، ويحدد بصريا tetrads على صفيحة أجار ويعمل جهاز مياداة مجهرية تحديد بصريا tetrads على صفيحة أجار وباستخدام مياداة مجهرية لنقل الرباعيات إلى منطقة خالية من الخلايا من لوحة. المقبل، وجراثيم أربعة في الرباعيات يجب فصل جسديا لمنع interspore التزاوج. وتعقد جراثيم داخل الرباعيات معا عن طريق كل من زق، وبقايا جدار الخلية للخلية مضاعفا الأصلي، ومجموعة من الجسور interspore 5. في تحليل الرباعيات التقليدية تتم إزالة زق بواسطة الهضم الأنزيمي، ويستخدم الباحث مياداة مجهرية لكسر الجسور interspore وندف بصرف النظر الجراثيم. أخيرا، يتم المحتشدة الجراثيم الفردية في نمط الشبكية التي تحافظ على العلاقة بين الجراثيم، أي جميع ذرية في صف واحد من الأربعة هي جراثيم شقيقة من نفس الرباعيات الأصلي. باحث الخميرة شهدت يمكن إكمال عملية تشريح 10 tetrads (عدد الحد الأدنى المقبولة عمومافي الصليب) في حوالي 15 دقيقة.
قمنا بتطوير الإنتاجية العالية طريقة الرباعيات التنميط الجيني الجديد الذي نسميه ب arcode E nabled S T equencing من etrads (بست) 1. أفضل يوسع عليه الأساليب الحالية في مجال علم الوراثة عالية الإنتاجية من خلال تمكين الجيل والتنميط الجيني لأعداد كبيرة من ذرية التي هي معزولة، مرمزة بالجينات، والحفاظ على كأفراد بطريقة تسمح للعلاقات بوغ الشقيقة من جميع المنتجات الانتصافي أربعة لاستردادها. ويتم إنجاز ذلك باستخدام ثلاث استراتيجيات رئيسية (الشكل 1). الأول هو إدخال بناء المراسل أن التسميات الخلايا التي خضعت الانقسام الاختزالي مع GFP، ويسمح لها أن تكون معزولة من قبل الخلية مضان تنشيط الفرز (FACS). هي ثاني إدراج رمز شريطي الحمض النووي معقدة للغاية (سلسلة من 15 النيوكليوتيدات عشوائي) في شكل يمكن أن ينتقل إلى جميع الجراثيم أربعة من الرباعيات ويمكن قراءتها من قبل تسلسل الحمض النووي المؤتلف من PROGENذ وبالتالي يحدد جراثيم شقيقة من نفس الرباعيات. هي ثالث خطوة التنميط الجيني، وأفضل متوافق مع العديد من المنصات التي التنميط الجيني التقاط كل من مجموعة من علامات الجيني وكذلك الباركود الرباعيات محددة. نحن توظيف تقييد الحمض النووي المرتبط موقع العلامة التسلسل (RAD وما يليها) 6 الأسلوب الذي يوجه تسلسل الجينوم إلى مواقع محددة تقييد 1، وبالتالي التقاط متسقة 2-3٪ من الجينوم من سلالات ذرية وكذلك الباركود المنقولة البلازميد . انتعاش العلاقات الرباعيات جنبا إلى جنب مع البيانات المستمدة تجريبيا التنميط الجيني عن الصليب يسمح الاستدلال الدقيق للمعلومات في عداد المفقودين، بما في ذلك وضع علامات منخفضة مع تغطية تسلسل وراثى كاملة من الأفراد inviable (وبالتالي غير قابل للاسترداد). هنا، نحن تصف تطبيق الأسلوب في الكائنات الحية الدقيقة الأكثر استخداما لرسم الخرائط الانتصافي، الخميرة S. الخباز. ومع ذلك، مع استبدال طفيفة من الجرمية كائن محددةأيها السادة، مثل البروتينات تبوغ محددة مختلفة تنصهر إلى GFP، ينبغي أن تكون طريقة للتحويل بسهولة إلى الكائنات الدقيقة الأخرى، بما في ذلك الكائنات التي رسم الخرائط الانتصافي هو أكثر بكثير كثيفة العمالة أو مستعصية على الحل في الوقت الراهن.
الشكل 1. أفضل طريقة. (A) البلازميد pCL2_BC هو البلازميد 2 ميكرون مع GFP الانصهار تبوغ محددة، ومقاومة للG418، والباركود عشوائي 15 مير. يوصف بناء مكتبة البلازميد في دلو وآخرون 1. (ب) يتم تحويل بركة من البلازميدات barcoded في سلالة مضاعفا من كرة عرضية. ثم تزرع (C) Transformants على الاختيار ويتم تجميع ~ 10،000 المستعمرات تحولت وsporulated من. أثناء الانقسام الاختزالي كل بوغ من الرباعيات يرث المشتركPY من البلازميد barcoded. يتم فصل (D) Tetrads من خلايا unsporulated بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية والتي تم جمعها على لوحات أجار، حيث يتم هضمها والتي عطلت إتاحة الفرصة أمام كل بوغ لتشكيل مستعمرة. ثم يتم اختيار (E) المستعمرات في لوحات 96 جيدا، phenotyped، ومرمزة بالجينات. خلال التنميط الجيني تتم قراءة الباركود البلازميد وتستخدم لتحديد أربعة أعضاء من كل الرباعيات. تم تعديل هذا الرقم من دلو وآخرون 1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
مناطق كثيرة من أبحاث الوراثة، بدءا من تعيين سمة معقدة 11 لدراسة الآليات الكامنة وراء إعادة التركيب DNA 12، تتطلب أعداد كبيرة للغاية من ذرية وكميات كبيرة من تسلسل الحمض النووي. التقنيات التي تتزوج قوة الأساليب التقليدية مع قدرة إنتاجية عالية تسلسل الحمض النووي لديها القدرة على تمكين الدراسات التي كانت مستعصية سابقا. على الرغم من أن العديد من الإنتاجية العالية الوراثة الخميرة أساليب تم تطبيقها على نحو فعال لمشاكل محددة، لكل منها القيود التي تقصر من تطبيق واسعة للتحليل الرباعيات التقليدية. أفضل عناوين هذه التحديات من خلال توظيف نهج الإنتاجية العالية الجمع بين تشريح الرباعيات والتنميط الجيني ذرية من الصلبان الخميرة. بالتزامن مع المضاعفة RAD علامة التسلسل، وأفضل يوفر وسيلة غير مكلفة لاستخلاص المعلومات الوراثي لكل سلالة ذرية مع الحفاظ على علاقات الرباعيات عن طريق الباركود الرباعيات فريدة من نوعها.0؛ من استخدام كافة أساليب إنتاجية عالية في الوقت الراهن، وأفضل يلخص أوثق المعلومات التي تقدمها عبر الخميرة تشريح يدويا.
أفضل اثنين من السمات الرئيسية. الأول هو استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية لعزل بسرعة tetrads بعيدا عن خلايا unsporulated في الثقافة (بروتوكول الخطوات 5-6). القدرة على عزل الآلاف من الأحداث الفلورسنت (tetrads) يعطي أفضل أكبر مكاسبه في الإنتاجية. يوفر هذا أتمتة ميزة أكبر دليل على تشريح لالصلبان مع انخفاض كفاءة تبوغ، ويرجع ذلك إلى زيادة الوقت اللازم لتحديد بصريا الأحداث النادرة. ميزة المفتاح الثاني هو استخدام الباركود الجزيئية المعقدة للغاية (البروتوكول الخطوة 2) التي تبث إلى كل بوغ أخت من الرباعيات. لأن هذه الرموز الشريطية يمكن استخدامها لإعادة بناء العلاقات حسابيا الرباعيات بين الجراثيم التي تم توزيعها عشوائيا عبر لوحة آغار، والحاجة إلى يدويا الخلايا مجموعة في الشبكة أمر يتم إنزال. أخيرا،لأن الباركود الجزيئية والجينات مراسل GFP تبوغ محددة ترتبط جسديا (على نفس البلازميد)، ويتم اختيار tetrads الوحيدة التي احتفظت الباركود الجزيئية عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية الفرز.
هناك نوعان من الاعتبارات التي تحكم طول الفترة الزمنية التي ينبغي الثقافات المحتضنة في المتوسط تبوغ. أولا، لأن ما يعبر عنه مراسل محددة تبوغ (SPS2-GFP) في الانقسام الاختزالي في وقت مبكر، GFP وحده لا يميز كاملة tetrads 4 بوغ من الخلايا التي لم تكتمل الانقسام الاختزالي (أي dyads). في حين تبوب FACS إضافية قد يقلل من عدد من الفلورسنت، tetrads غير مكتملة، وأسهل طريقة لخفض هذه الأحداث غير المرغوب فيها وببساطة رصد الثقافة تبوغ (الخطوة 3.3) والشروع توقفت مرة واحدة tetrads جديدة تشكيل. في تجاربنا، وتواتر dyads فرز أقل من 1٪. الثانية، بالنسبة لبعض الصلبان وقتا إضافيا قضى في تبوغ المتوسطة في RT دون التحريض (الخطوة 3.4) سيجيحسن nificantly فصل tetrads من الخرز الزجاجي أثناء الطلاء ((بروتوكول الخطوة 6)، وفي الواقع، هذه الخطوة ضرورية للغاية لتعطيل بعض الصلبان.
مثل كل أساليب إنتاجية عالية، وأفضل هو "ضجيج" من النهج التقليدي المقابلة. تخفيض متواضع في كفاءة أفضل مقارنة الرباعيات تشريح التقليدية يمكن أن تنجم عن مزيج من عدة عوامل. أحد العوامل هو فقدان متزايد من الجراثيم قابلة للحياة على خلاف ذلك، والتي يمكن أن تنجم عن الانضمام إلى حبات الزجاج خلال نشر أو زيادة بوغ الموت بسبب الضغوط الميكانيكية لهذه العملية. وهناك عامل ثان يمكن أن يكون فقدان البلازميد بسيطة أثناء الانقسام الاختزالي. هناك عامل ثالث يمكن أن يكون انخفاض فعالية في المستعمرات صالحة للاستعمال الناتجة عن المستعمرات مع الأنماط الوراثية المختلطة، ما يقدر ب ~ 5٪ من المستعمرات في الطيار لدينا الصلبان 1. فمن المرجح أن هذه المستعمرات تمثل إخفاقات شقيقة بوغ الانفصال. لأن فلوري السريعescence الفرز والفصل بوغ تسمح جمع أعداد هائلة من tetrads، وقد تم تجهيز أفضل بشكل جيد للتغلب على النقص في الكفاءة على هذا النطاق. في حين التكرار مستقبل أفضل يمكن زيادة الكفاءة تقترب من تشريح دليل، فإنه ربما يكون من المرجح أن مسار الأسي الحالي من الحمض النووي القدرة التسلسل سوف تعوض سريعا لهذا المستوى من فقدان سلالة صالحة للاستعمال. بغض النظر، فإن القدرة على إجراء تحليل الرباعيات على نطاق والتي أفضل يمكن تطبيقها تمكين الدراسات التي هي غير مجدية بواسطة الطرق اليدوية حاليا.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة على جائزة / NHGRI الجينوم الباحث العلمي / كلية الانتقالية (K22 HG002908) لAMD وشراكة استراتيجية بين معهد بيولوجيا الأنظمة وجامعة لوكسمبورغ. طلبات سلالات أو البلازميدات ينبغي أن توجه إلى ايمي دادلي (aimee.dudley @ gmail.com).
FACSAria II (Special order unit) | BD Biosciences | – | Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto petri dishes (which may need |
Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II) | BD Biosciences | 643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument) | |
Zymolyase 100T | Seikagaku Biobusiness | ||
G418 | A.G. Scientific | http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html |