四分子のバーコード有効シング(ベスト)四分子を単離崩壊さと間隔の手動プロセスを置き換えます。ベスト寒天プレート上に蛍光活性化細胞選別による四分子を分離、ガラスビーズを攪拌することにより胞子を分離して、ランダムに配列されたコロニーは、分子バーコードを使用して、同じ元の四分子から誘導されたかを決定します。
四分子分析は、酵母遺伝学のための貴重なツールであるが、プロセスの煩雑な手動の性質は、大規模なスケールでの適用を妨げてきた。バーコードは四分子の配列(BEST)1は 、分離破壊し、四分子間隔の手動プロセスに取って代わることができました。 BESTは、子嚢を酵素的に消化し、胞子を破壊し、ランダムにガラスビーズめっきにより配列されている直接寒天プレート上に四分子の蛍光活性化細胞選別を可能にする胞子形成特異的GFP融合タンパク質のおかげで四分子を分離する。胞子はジェノタイピング中に読み込ま分子バーコードを使用して、同じ四分子に由来すなわち情報かについての半数体コロニーは、その後、姉妹胞子関係が割り当てられます。マニュアル解剖のボトルネックを除去することにより、四分子の数百または数千、数分で単離することができる。ここでは、酵母においてBESTを実行するために必要な実験手順の詳細な説明を提示するサッカロマイセス·セレビシエ 、半数体減数分裂子孫から派生したコロニーの分離を通じてヘテロ接合二倍体株で始まる。
一般的に四分子分析として知られる減数分裂遺伝子マッピングは、酵母遺伝学の中心である。簡単に言えば、それぞれがそれぞれの染色体の単一コピーを含む2半数体株は、各染色体の2つのコピー、各親からの1とヘテロ接合二倍体の歪みを形成するために交配させる。窒素のための二倍体細胞を飢餓と、染色体は、複製転位を受けて、それぞれの親からの対立遺伝子の新しい組み合わせで4半数体細胞(胞子または分離個体)に分割(胞子形成)が減数分裂を誘導する。シングル減数分裂によって生じる4胞子は四分子解剖と呼ばれる手動プロセスによって単離することができる。
1937 4に初版発行以来、比較的ほとんど変わっていない従来の四分子解剖2,3は 、三つの目標を持っています。まず、減数分裂(四分子)を受けた細胞は栄養細胞の背景から単離されなければならない。従来の分析では、これを用いて、研究者によって達成される顕微鏡は、視覚的に寒天プレート上に四分子を識別し、マイクロマニピュレータ装置が視覚的に寒天プレート上に四分子を同定し、プレートの無細胞領域に四分子を移動させるためにマイクロマニピュレーターを用いて使用する。次に、四分子中の4胞子はinterspore交配を防ぐために、物理的に分離しなければならない。四分子内の胞子嚢は、元の二倍体細胞、及びintersporeブリッジ5のセットの細胞壁の残留両方によって一緒に保持される。従来の四分子分析で子嚢を酵素消化により除去し、研究者はinterspore橋を破壊し、胞子を離れていじめるマイクロマニピュレーターを使用しています。最後に、個々の胞子が胞子との関係を維持してグリッド状に配列された4つの行、すなわち 、すべての子孫は、同じ元四分子の姉妹胞子である。経験豊富な酵母の研究者は、10四分子(一般に公正妥当と認められる最小数を解剖するプロセスを完了することができます約15分)のクロスあたり。
我々は、B arcode、EがT etrads(BEST)1 のS equencingをnabled呼び出す新しい高スループット四分子ジェノタイピング法を開発した。ベストは単離されているの子孫が多数、遺伝子型を決定し、すべての4減数分裂の製品の姉妹胞子の関係を回復することを可能にする方法で、個人として維持の発生や遺伝子タイピングを可能にすることにより、ハイスループット遺伝学の現在の方法を発展させ。これは、3つの主要な戦略( 図1)を用いて達成される。第GFPと減数分裂を受けた細胞を標識し、それらを(FACS)を蛍光活性化細胞ソーティングによって単離することを可能にするレポーター構築物の導入である。第四分子の4つ全ての胞子に伝達され、組換えPROGENのDNA配列決定によって読み取ることができる形態の非常に複雑なDNAバーコードの取り込み(15ランダムヌクレオチドの文字列)であるしたがって、Yとは、同一の四分子から姉妹胞子を識別します。第三は、遺伝子型判定ステップであり、最高のゲノムマーカーのセットだけでなく、四分子固有のバーコードの両方をキャプチャし、多数のジェノタイピング·プラットフォームと互換性があります。我々はそれによって子孫株のゲノムの一貫した2から3パーセントだけでなく、プラスミド由来のバーコードをキャプチャする、制限部位に関連したDNAタグシーケンシング(RAD-SEQ)特定の制限部位1にゲノム配列決定を指示する6方法を採用。クロスから経験的に由来ジェノタイピングデータとともに四分子の関係の回復は低い配列カバレッジと生存不能(したがって、回復不可能な)個人の完全な遺伝子型とマーカーのステータスなどの情報が不足しての正確な推定を可能にする。ここでは、減数分裂のマッピングのための最も一般的に使用される微生物は、酵母S.の方法の適用を記載サッカロミセス·セレビシエが 、生物特異的REAのマイナー置換を有するメンズ、GFPに融合した例えば 、異なる胞子特異的タンパク質、方法が減数分裂のマッピングはかなり多くの労力を要するか、現在難治である生物を含む他の微生物には容易に譲渡する必要があります。
図1。最善の方法。(A)pCL2_BCプラスミドは胞子特有のGFP融合、G418に対する耐性、および15-merのランダムバーコードと2ミクロンプラスミドである。プラスミドライブラリーの構築は、ラドローら 1に記載されている。 (B)バーコードプラスミドのプールは、クロスからの二倍体株に形質転換されている。 (C)形質転換体は、その後の選択に成長させ、〜万形質転換コロニーをプールし、胞子形成されています。減数分裂の際に四分子の各胞子は、COを継承バーコードプラスミドのPY。 (D)四分子を、FACSによってオーシスト細胞から分離し、それらを消化し 、それぞれの胞子コロニーを形成することができるように破壊されている寒天プレート上に収集される。 (E)コロニーを、次いで、96ウェルプレートに採取表現型および遺伝子型決定される。ジェノタイピング中にプラスミドバーコードが読み取られ、各四分子の4メンバーを同定するために使用される。この図は、ラドローら 1から変更されている。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
複雑な形質のマッピング11からDNA組換え12のメカニズムの研究に至る遺伝学研究の多くの分野は、子孫およびDNA配列の大量の非常に多くを必要とする。ハイスループットDNA配列決定の容量を持つ従来のアプローチの力を結婚する技法は、以前は難治性であった研究を可能にする可能性を有する。いくつかのハイスループット酵母遺伝学法は、特定の問題に効果的に適用されてきたが、それぞれが従来の四分子分析の幅広い適用を下回るの制限があります。四分子解剖を組み合わせたハイスループットアプローチを採用し、酵母の交配の子孫の遺伝子型で、最良のアドレスこれらの課題。多重化されたRAD-タグシーケンシングと組み合わせて、最高のユニークな四分子のバーコードを用いて四分子の関係を維持しながら、各々の子孫株について遺伝子型情報を収集するために安価な方法を提供しています。0;すべての現在使用されているハイスループット方法のうち、BESTは、最も密接に手動で切開し、酵母断面によって提供される情報を再現する。
ベストは、次の2つの主要機能を備えています。最初は急速に離れて文化(プロトコールステップ5-6)中のオーシストの細胞から四分子を分離するため、FACSを使用することである。蛍光イベント(四分子)の数千人を単離する能力は、最高のスループットでの最大のゲインを提供します。この自動化により、視覚的に稀な事象を識別するために必要な時間の増加に、低胞子形成効率との交雑のためのマニュアルの解剖上のさらに大きな利点を提供する。第二の重要な特徴は、四分子の各姉妹胞子に伝達され、非常に複雑な分子バーコード(プロトコールステップ2)を使用することである。これらのバーコードは、計算上、ランダムに寒天平板上に分散された胞子間の四分子の関係を再構築するために使用することができるため、必要が手動で注文し、グリッド内のアレイ·セルは緩和されます。最後に、分子バーコードと胞子形成特異的GFPレポーター遺伝子が物理的に(同じプラスミド上)リンクされているため、分子バーコードを保持している唯一の四分子は、FACSソーティングにより選択される。
培養物を胞子形成培地中でインキュベートされるべきである時間の長さを支配する2つの考慮事項が存在する。胞子形成特異的レポーター(SPS2-GFP)は 、早期減数分裂で表現されるので、最初、GFP単独では、減数分裂( すなわちダイアド)が完了していない細胞から完全な4 -胞子四分子を区別しません。追加のFACSゲーティングは、蛍光、不完全な四分子の数を減少させることができるが、これらの不要なイベントを減少させる最も簡単な方法は、単純に胞子形成の文化を監視する(3.3ステップ)と新しい四分子形成を停止した後は進んでいます。我々の実験では、ソートダイアドの頻度は1%未満である。第二に、いくつかの交配のために撹拌せずに室温で胞子形成培地で過ごした追加時間(ステップ3.4)SIGnificantly((プロトコルステップ6)、めっき中にガラスビーズによる四分子の分離を向上させます。実際には、このステップは、いくつかの交配の破壊のために絶対に必要です。
すべての高スループット法と同様に、最高の対応する従来のアプローチよりも「騒々しい」です。従来の四分子解剖と比較した最高の効率のわずかな減少は、いくつかの要因の組み合わせから発生する可能性があります。一つの要因は、プロセスの機械的応力に胞子の死滅を拡散または増加中のガラスビーズへの付着に起因する可能性がある、そうでなければ、生存胞子の増加した損失である。第二の要因は、減数分裂の間の単純なプラスミド損失である可能性があります。第三の要因は、我々のパイロットでコロニーの推定〜5%は1を横切る、混合遺伝子型を有するコロニーから生じた使用可能なコロニーに効果的な減少である可能性があります。それは、これらのコロニーは、姉妹胞子分離の失敗を表している可能性があります。急速なフッ素理由escenceソートや胞子分離は四分子の膨大な数のコレクションを許可し、ベストはよく、この規模での効率の低下を克服するために装備されている。 BESTの将来の反復は手動解剖に近い効率を高めることができるが、それはDNA配列決定能力の指数関数的な電流の軌跡が急激に利用可能な株損失のこのレベルを補償することがおそらく可能性が高い。それにもかかわらず、BESTを適用可能な規模で四分子分析を実行する能力は、現在、手動の方法によって、実現不可能である研究を可能にする。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、AMDとシステム生物学とルクセンブルクの大学研究所との間の戦略的パートナーシップにNIH / NHGRIゲノム学者/教員トランジション賞(K22 HG002908)によってサポートされていました。株やプラスミドの要求は、エイミーダドリー(aimee.dudley @ gmail.com)に向けられるべき。
FACSAria II (Special order unit) | BD Biosciences | – | Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto petri dishes (which may need |
Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II) | BD Biosciences | 643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument) | |
Zymolyase 100T | Seikagaku Biobusiness | ||
G418 | A.G. Scientific | http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html |