Штрих Enabled Секвенирование тетрад (BEST) заменяет ручные процессы выделения, нарушая и расстояние тетрады. ЛУЧШИЙ изолирует тетрады с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток на чашках с агаром, отделяет споры при перемешивании со стеклянными шариками, и определяет, какие случайно выстроенные колонии были получены из того же исходного тетрады с использованием молекулярных штрих-кодов.
Тетрадного анализа является ценным инструментом для дрожжевых генетики, но кропотливая ручная характер процесса препятствовал его применение в больших масштабах. Штрих Enabled Секвенирование тетрад (BEST) 1 заменяет ручной процессы выделения, нарушая и расстояние тетрады. ЛУЧШИЙ изолирует тетрады в силу споруляции конкретных GFP слитого белка, который обеспечивает флуоресцентно-активированном сортировки клеток тетрад непосредственно на чашках с агаром, где аск ферментативно переваренных и споры разрушенных и случайным образом, выстроенных на стеклянной бусины обшивки. Гаплоидного колонии затем присваивается сестра спор отношения, т.е. информация о которых споры возник из той же тетрады, с использованием молекулярных штрих-кодов для чтения во время генотипирования. Удаляя узкое ручного вскрытия, сотни или даже тысячи тетрад могут быть выделены в считанные минуты. Здесь мы представляем подробное описание экспериментальных процедур, необходимых для выполнения лучших в дрожжахSaccharomyces CEREVISIAE, начиная с гетерозиготной диплоидной процедить через изоляцию колоний, полученных из гаплоидного мейоза потомства.
Мейотических отображение ген, известный как тетрадного анализа, занимает центральное место в дрожжевых генетики. Вкратце, два гаплоидных штаммов, каждый из которых содержит одну копию каждой хромосомы, в паре с образованием гетерозиготное диплоидный штамм с двумя копиями каждой хромосомы, по одному от каждого родителя. Голодающие диплоидных клеток для азота вызывает мейоза (споруляция), в котором хромосомы дублировать, пройти перегруппировку, и разделить на четыре гаплоидных клеток (спор или сегрегантов) с новыми комбинациями аллелей от каждого родителя. Четыре споры, вытекающие из одного мейоза может быть выделен с помощью ручного процесса, называемого тетрад рассечение.
Обычные тетрада рассечение 2,3, который практически не изменился с момента первой публикации в 1937 году 4, имеет три цели. Во-первых, клетки, которые подверглись мейоза (тетрад) должны быть изолированы от фоне вегетативных клеток. В обычном анализе, это достигается путем исследователя, который, используямикроскоп, визуально идентифицирует тетрады на чашке с агаром, и использует микроманипулятор аппарат визуально идентифицировать тетрады на чашке с агаром, и с помощью микроманипулятор для перемещения тетраду на область бесклеточной пластины. Далее, четыре споры в тетрады должны быть физически разделены во избежание interspore спаривания. Споры внутри тетрады скрепляются как в сумке, оставшихся в клеточной стенке оригинального диплоидной клетке, и набор interspore мостов 5. В обычной тетрадного анализа аск удаляется путем ферментативного пищеварения, и исследователь использует микроманипулятор сломать interspore мосты и дразнить друг от друга споры. Наконец, отдельные споры облеченные в решетчатой узором, который поддерживает связь между спорами, то есть все потомство в ряду четырех являются сестра споры той же исходной тетрады. Опытный дрожжи исследователь может завершить процесс рассечения 10 тетрады (общепринятая минимальное количествоза крест) в 15 мин.
Мы разработали новую высокой пропускной метод тетрада генотипирования, которое мы называем Б arcode E nabled S equencing Т etrads (BEST) 1. ЛУЧШИЙ расширяет текущих методов в высокой пропускной генетики, позволяя генерацию и генотипирование большого количества потомства, которые изолированы, генотипированных, и поддерживается как лиц и организаций в манере, которая позволяет сестринские споры отношения всех четырех мейотических продуктов, которые будут восстановлены. Это достигается с помощью трех основных стратегий (рис. 1). Во-первых, это введение репортерной конструкцией, которая маркирует клетки, которые подверглись мейоза с GFP и позволяет им быть изолированы с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток (FACS). Во-вторых, включение очень сложной штрих-кода ДНК (строка 15 случайных нуклеотидов) в форме, которая передается на все четыре спор тетрады и может быть прочитан секвенирования ДНК рекомбинантного Progenу и, таким образом, определяет родственные спор из одной тетрады. В-третьих, это шаг генотипирование, и ЛУЧШИЙ совместим с многочисленными генотипирования платформ, которые захватывают и набор геномных маркеров, а также тетрада конкретных штрих. Мы используем сайт рестрикции ДНК-ассоциированной последовательности тэгов (RAD-SEQ 6) метод, который направляет секвенирование генома с конкретными сайтами рестрикции 1, тем самым захватывая последовательную 2-3% генома штаммов потомства, а также плазмиду переносимых штрих-кода . Восстановление тетрадных отношений наряду с эмпирически-производного генотипирования данных с креста позволяет точно вывод о недостающей информации, в том числе статуса маркеров с низким охватом последовательности и полного генотипа нежизнеспособных (и, следовательно, не читается) лиц. Здесь мы описываем применение метода в наиболее часто используемых микроорганизма для мейоза картография, дрожжей S. CEREVISIAE. Тем не менее, с незначительными замен организма конкретного Ригоспода, например, различные споруляции-специфических белков, слитые с GFP, метод должен быть легко воспроизведению в других микроорганизмов, в том числе организмы, в которых мейотическое отображение значительно более трудоемким или в настоящее время неразрешимыми.
Рисунок 1. Лучший метод. (А) pCL2_BC плазмиды является 2-мкм плазмиды с спорообразования конкретных GFP слияния, устойчивость к G418, и в 15-мерной случайной штрих-кода. Построение плазмиды библиотеки описано в Ludlow и др. 1. (В) пул штрих плазмид превращается в диплоидной деформации от креста. (C) Трансформанты затем выросли на выбор и ~ 10000 трансформированных колоний объединяют и спорулировались. Во время мейоза каждая спор из тетрады наследует совместноеру из штрих плазмиды. (D) Tetrads отделены от unsporulated клеток путем FACS и собирали на чашках с агаром, где они перевариваются и разрушали, чтобы каждый спор, чтобы сформировать колонии. (E) Колонии затем определена в 96-луночных планшетах, phenotyped, и генотипирование. Во генотипирования плазмида штрих считывается и используется для идентификации четырех членов каждой тетрады. Эта цифра была изменена с Ладлоу и др. 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Многие направления исследований генетики, начиная от комплексного картографирования признака 11 к изучению механизмов, лежащих в основе рекомбинации ДНК 12, требуют чрезвычайно большое количество потомства и большие объемы секвенирования ДНК. Методы, которые вступают в брак силу традиционных подходов с мощностью высокой пропускной последовательности ДНК имеют потенциал, чтобы исследования, которые ранее были неразрешимыми. Хотя несколько высокой пропускной методы дрожжей генетики были эффективно применены к конкретным проблемам, каждый из них имеет ограничения, которые не достигают широкой применимости обычной тетрадного анализа. ЛУЧШИЕ решает эти задачи за счет использования высокой пропускной подход, сочетающий тетрадный рассечение и генотипирования потомство дрожжей крестов. В сочетании с мультиплексированном RAD-тега секвенирования, ЛУЧШИЙ предлагает недорогой способ собрать информацию генотип для каждого штамма потомства при сохранении тетрадного отношения с помощью уникальных тетрадных штрих-кодов.0; Из всех в настоящее время используется высокие методы пропускной, ЛУЧШИЙ наиболее тесно повторяет информацию, представленную вручную расчлененного креста дрожжей.
ЛУЧШИЙ имеет две ключевые особенности. Первый состоит в использовании FACS быстро изолировать тетрады от unsporulated клеток в культуре (Протокол шаги 5-6). Возможность изолировать тысячи люминесцентных событий (тетрад) дает ЛУЧШИЙ наибольшее усиление пропускной способности. Этот автоматизации обеспечивает еще большее преимущество по сравнению с ручным вскрытия для скрещивания с низкой эффективностью споруляции, в связи с увеличением времени, необходимого для визуального определения редких событий. Функция второй ключ является использование очень сложной молекулярной штрих-кода (Протокол Шаг 2), которая передается каждому сестра споры о тетрады. Поскольку эти штрих-коды можно использовать для реконструкции в вычислительном тетрады отношения между спорами, которые были случайным образом распределены по чашке с агаром, необходимость вручную массива ячеек в упорядоченной сетки облегчены. Наконец,потому что молекулярная штрих-кода и ген GFP репортер споруляции конкретных физически связаны (на той же плазмиде), всего тетрады, которые сохранили молекулярную штрих-кода выбираются FACS сортировки.
Есть два соображения, которые регулируют длительность времени, что культуры должны инкубируют в споруляции среды. Во-первых, потому что споруляция конкретных репортер (SPS2-GFP) выражается в начале мейоза, в одиночку GFP не различает полные 4-спор тетрады из клеток, которые не завершенных мейоза (т.е. диад). В то время как дополнительная СУИМ стробирования может уменьшить количество люминесцентных, неполных тетрад, самый простой способ, чтобы уменьшить эти нежелательные события просто мониторинг споруляции культуры (Шаг 3.3) и исходя раз новые тетрады прекратили формирования. В наших экспериментах, частота диад, отсортированных составляет менее 1%. Во-вторых, в течение некоторого кресты дополнительного времени, проведенного в спорообразования среде при комнатной температуре без перемешивания (Шаг 3.4) сиговыхчительно улучшает разделение тетрадах на стеклянных шариков во время посева ((Протокол Шаг 6). На самом деле, этот шаг является абсолютно необходимым для разрушения некоторых крестах.
Как и все высокие методов пропускной, ЛУЧШИЙ является "шумнее", чем соответствующий традиционного подхода. Умеренное снижение эффективности лучше по сравнению с обычной тетрадного вскрытия может быть результатом комбинации нескольких факторов. Одним из факторов является повышенное выпадение из противном случае жизнеспособных спор, который может возникнуть в результате прилипания к стеклянных шариков во время расширения или увеличения спор смерти из-за механических напряжений процесса. Второй фактор может быть простым потери плазмиды во время мейоза. Третьим фактором может стать эффективным уменьшение используемых колоний в результате колоний со смешанными генотипов, по оценкам, ~ 5% от колоний в нашей пилота пересекает 1. Вполне вероятно, что эти колонии представляют неудачи разделения спор сестра. Потому что быстрое плавиковыйценции сортировки и разделения спор позволить сбор огромного числа тетрад, ЛУЧШИЙ хорошо оборудована, чтобы преодолеть снижение эффективности по данной шкале. В то время как будущие итерации лучших могли повысить эффективность приближается к ручной вскрытия, это, пожалуй, более вероятно, что нынешний экспоненциальный траектория ДНК секвенирования мощности будет быстро компенсировать этот уровень полезной потери натяжения. Несмотря на это, возможность выполнять тетрадный анализ по шкале, в которой ЛУЧШИЙ могут быть применены позволит исследований, которые в настоящее невозможным ручными способами.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана NIH / NHGRI Геном Академия / факультет переходный премии (K22 HG002908) в AMD и стратегического партнерства между Института системной биологии и Университета Люксембурга. Запросы на штаммов или плазмид должны быть направлены на Aimée Дадли (aimee.dudley @ gmail.com).
FACSAria II (Special order unit) | BD Biosciences | – | Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto petri dishes (which may need |
Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II) | BD Biosciences | 643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument) | |
Zymolyase 100T | Seikagaku Biobusiness | ||
G418 | A.G. Scientific | http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html |