Barcode Enabled séquençage de Tetrads (BEST) remplace les processus manuels d'isolement, de perturber et d'espacement tétrades. MEILLEUR isolats tétrades par cellule activé par fluorescence de tri sur les plaques d'agar-agar, sépare les spores par agitation avec des billes de verre, et qui détermine les colonies disposés de manière aléatoire ont été dérivées à partir de la même origine tétrade utilisant des codes à barres moléculaires.
Analyse Tetrad est un outil précieux pour la génétique de levure, mais la nature manuel laborieux du processus a entravé son application à grande échelle. Barcode Enabled séquençage de Tetrads (BEST) 1 remplace les processus manuels d'isolement, de perturber et d'espacement tétrades. MEILLEUR isolats tétrades en vertu d'une protéine fusion GFP-sporulation spécifique qui permet le tri cellulaire activé par fluorescence de tétrades directement sur des plaques d'agar-agar, où l'asque est une digestion enzymatique et les spores sont perturbés et disposés de façon aléatoire par des billes de verre de placage. Les colonies haploïdes sont ensuite affectés relations de spores sœurs, c'est à dire des informations sur les spores provenaient de la même tétrade, en utilisant des codes-barres moléculaires lus lors de génotypage. En éliminant le goulot d'étranglement de la dissection manuelle, des centaines voire des milliers de tétrades peuvent être isolés en quelques minutes. Nous présentons ici une description détaillée des procédures expérimentales nécessaires pour effectuer MEILLEUR dans la levureSaccharomyces cerevisiae, à partir d'une souche diploïde hétérozygote l'isolement des colonies dérivées de la descendance haploïde méiotique.
La cartographie des gènes de la méiose, communément connu comme l'analyse de tétrades, est au centre de génétique de la levure. En bref, deux souches haploïdes, contenant chacune un seul exemplaire de chaque chromosome, sont accouplés pour former une souche diploïde hétérozygote avec deux copies de chaque chromosome, un de chaque parent. Starving cellules diploïdes pour l'azote induit la méiose (sporulation) dans laquelle les chromosomes en double, subissent un réarrangement, et se divisent en quatre cellules haploïdes (spores ou ségrégeants) avec de nouvelles combinaisons d'allèles de chaque parent. Les quatre spores résultant d'une seule méiose peuvent être isolées par un procédé manuel intitulé dissection tétrade.
Classique tétrade dissection 2,3 qui a relativement peu changé depuis la publication originale en 1937 4, a trois objectifs. Tout d'abord, les cellules qui ont subi une méiose (tétrades) doivent être isolés à partir d'un fond de cellules végétatives. Dans une analyse classique, ceci est réalisé par un chercheur qui, à l'aideun microscope, identifie visuellement tétrades sur une plaque de gélose et emploie un appareil de micromanipulateur identifier visuellement tétrades sur une plaque de gélose et l'aide d'un micromanipulateur pour déplacer la tétrade sur une zone de libre-cellulaire de la plaque. Ensuite, les quatre spores dans la tétrade doivent être séparés physiquement pour empêcher Interspore accouplement. Spores dans une tétrade sont maintenues ensemble par les deux un asque, le reste de la paroi cellulaire de la cellule diploïde d'origine, et un ensemble de ponts Interspore 5. Dans l'analyse de la tétrade classique asque est éliminé par digestion enzymatique, et un chercheur utilise le micromanipulateur de rompre les ponts Interspore et démêler les spores. Enfin, les spores individuelles sont disposées selon un motif quadrillé qui maintient la relation entre les spores, c'est à dire toute la descendance dans une rangée de quatre spores sont sœurs de la même tétrade originale. Un chercheur de levure expérimenté peut compléter le processus de dissection 10 tétrades (un nombre minimum généralement reconnuspar croix) dans environ 15 min.
Nous avons développé une nouvelle méthode tétrade génotypage à haut débit, que nous appelons B arcode E nabled S equencing de T etrads (BEST) 1. MEILLEUR élargit les méthodes actuelles de la génétique à haut débit en permettant la génération et le génotypage d'un grand nombre de descendants qui sont isolés, génotypés et entretenus comme des individus d'une manière qui permet aux sœurs relations de spores de quatre produits de la méiose à récupérer. Ceci est accompli en utilisant trois stratégies principales (figure 1). La première est l'introduction d'une construction de rapporteur qui marque les cellules qui ont subi une méiose avec la GFP et leur permet d'être isolés par des cellules activées par fluorescence (FACS). La deuxième est l'incorporation d'un code à barres de l'ADN hautement complexe (une chaîne de 15 nucleotides aléatoires) sous une forme qui est transmis à l'ensemble des quatre spores d'une tétrade et peut être lu par le séquençage de l'ADN recombinant de la Progeny et ainsi identifie spores sœurs de la même tétrade. Troisièmement, il ya l'étape de génotypage et le meilleur est compatible avec de nombreuses plates-formes de génotypage qui captent à la fois un ensemble de marqueurs génomiques ainsi que le code-barres spécifique tétrade. Nous utilisons une séquence de restriction associée au site de l'ADN tag (RAD-seq) 6 Procédé qui dirige le séquençage du génome de sites de restriction spécifiques 1, capturant ainsi une cohérence 2-3% du génome des souches de la descendance ainsi que le code à barres de diffusion plasmidique . La récupération de relations de tétrades ainsi que les données de génotypage empiriquement dérivées d'un croisement permet l'inférence précise des informations manquantes, y compris l'état de marqueurs à faible couverture et la séquence complète du génotype des individus non viables (et donc non récupérable). Ici, nous décrivons l'application de la méthode dans le micro-organisme le plus couramment utilisé pour la cartographie de la méiose, la levure S. cerevisiae. Cependant, avec des substitutions mineures de rea spécifique-organismemessieurs, par exemple différentes protéines spécifiques sporulation fusionnés à la GFP, la méthode doivent être facilement transférables à d'autres micro-organismes, y compris les organismes dans lesquels la cartographie de la méiose est beaucoup plus de main-d'œuvre ou actuellement intraitable.
Figure 1. MEILLEUR procédé (A). PCL2_BC Le plasmide est un plasmide de 2 microns avec une fusion GFP-spécifique de la sporulation, la résistance au G418, et un code à barres 15-mère aléatoire. Construction de la banque de plasmides est décrite dans une Ludlow et al. (B) Un pool de plasmides à code-barres est transformé dans la souche diploïde à partir d'une croix. (C) Les transformants sont ensuite cultivées sur la sélection et ~ 10 000 colonies transformées sont mises en commun et sporulés. Au cours de la méiose chaque spore d'une tétrade hérite d'une coopérationpy du plasmide code-barres. (D) Tetrads sont séparées des cellules non sporulés par FACS et recueillies sur des plaques de gélose, où ils sont digérés et perturbé pour permettre à chaque spore pour former une colonie. (E) Les colonies sont ensuite ramassés dans des plaques à 96 puits, phénotypées, et génotypés. Au cours de génotypage du code à barres de plasmide est lu et utilisé pour identifier les quatre membres de chaque tétrade. Ce chiffre a été modifié de Ludlow et al 1. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
De nombreux domaines de la recherche en génétique, allant de la cartographie caractère complexe 11 à l'étude des mécanismes sous-jacents recombinaison de l'ADN 12, nécessitent un très grand nombre de descendants et des volumes élevés de séquençage de l'ADN. Les techniques qui épousent la puissance d'approches conventionnelles dont la capacité de séquençage d'ADN à haut débit ont le potentiel pour permettre à des études qui étaient auparavant insoluble. Bien que plusieurs haut-débit génétique de levure méthodes ont été appliquées de manière efficace à des problèmes spécifiques, chacun a des limites qui sont loin de la large applicabilité de l'analyse de tétrade classique. Les meilleures adresses à ces défis en adoptant une approche à haut débit combinant tétrade dissection et génotypage de la descendance de croisements de levure. En collaboration avec multiplexé RAD-tag séquençage, le BEST offre un moyen peu coûteux de glaner des informations de génotype pour chaque souche de descendance tout en préservant les relations tétrade au moyen de codes à barres tétrade uniques.0; De tous actuellement utilisé méthodes à haut débit, le BEST récapitule plus étroitement les informations fournies par un centre de levure disséqué manuellement.
Best a deux caractéristiques principales. Le premier est l'utilisation de FACS pour isoler rapidement tétrades distance à partir de cellules non sporulés dans la culture (Protocole étapes 5-6). La capacité d'isoler des milliers d'événements fluorescents (de tétrades) donne le meilleur son plus grand gain en débit. Cette automatisation permet un avantage encore plus grand sur la dissection manuelle pour les croisements avec la faible efficacité de la sporulation, en raison de l'augmentation du temps nécessaire pour identifier visuellement des événements rares. Le deuxième élément clé est l'utilisation d'un code-barres moléculaire très complexe (protocole de l'étape 2) qui est transmis à chaque spore de sœur d'une tétrade. Parce que ces codes à barres peuvent être utilisées pour des calculs reconstruire les relations entre les tétrades spores qui ont été distribuées de façon aléatoire à travers une plaque de gélose, de la nécessité de main cellules de tableau dans une grille ordonnée est atténué. Enfin,parce que le code à barres moléculaire et le gène rapporteur GFP-spécifique de la sporulation sont physiquement liés (sur le même plasmide), seuls les tétrades qui ont conservé le code à barres moléculaire sont sélectionnées par tri FACS.
Il existe deux considérations qui régissent la durée pendant laquelle les cultures doivent être incubées dans le milieu de sporulation. D'abord, parce que le rapporteur spécifique de la sporulation (SPS2-GFP) est exprimé au début de la méiose, la GFP seule ne fait pas de distinction complets tétrades 4 spores de cellules qui n'ont pas terminé la méiose (c. dyades). Bien FACS supplémentaire déclenchement peut diminuer le nombre de fluorescents, tétrades incomplètes, la meilleure façon de réduire ces événements indésirables est tout simplement suivi la culture de sporulation (étape 3.3) et de procéder une fois de nouvelles tétrades ont cessé de se former. Dans nos expériences, la fréquence des dyades trié est inférieure à 1%. Deuxièmement, pour certains croisements temps supplémentaire passé dans un milieu de sporulation à la température ambiante sans agitation (étape 3.4) significantly améliore la séparation des tétrades par les perles de verre pendant le placage ((Protocole de l'étape 6). En fait, cette étape est absolument nécessaire pour la rupture de certains des croisements.
Comme toutes les méthodes à haut débit, le mieux est "bruyants" que l'approche conventionnelle correspondant. La réduction modeste de l'efficacité de meilleur par rapport à la dissection de tétrade classique pourrait résulter d'une combinaison de plusieurs facteurs. Un facteur est la perte accrue de spores viables par ailleurs, ce qui pourrait résulter de l'adhérence à des perles de verre lors de l'épandage ou une augmentation de la mort des spores en raison des contraintes mécaniques du processus. Un deuxième facteur pourrait être la perte de plasmide simple, lors de la méiose. Un troisième facteur pourrait être une diminution effective de colonies utilisables résultant de colonies de génotypes mixtes, environ ~ 5% des colonies dans notre pilote traverse 1. Il est probable que ces colonies représentent échecs de soeur spore séparation. Parce que le fluor rapideescence tri et la séparation des spores permettre la collecte d'énormes nombre de tétrades, BEST est bien équipé pour surmonter diminue l'efficacité de cette ampleur. Alors que les versions futures de MEILLEUR pourraient accroître l'efficacité proche de celle de dissection manuelle, il est peut-être plus probable que la trajectoire exponentielle actuelle de la capacité de séquençage de l'ADN sera rapidement compenser ce niveau de perte utilisable de souche. Quoiqu'il en soit, la capacité d'effectuer une analyse tétrade sur l'échelle à laquelle MEILLEUR peut être appliqué permettra études qui sont actuellement irréalisable par des méthodes manuelles.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par une bourse NIH / NHGRI Génome Scholar / Faculté de transition (K22 HG002908) pour AMD et un partenariat stratégique entre l'Institute for Systems Biology et l'Université du Luxembourg. Les souches ou des plasmides doivent être adressées à Aimée Dudley (aimee.dudley @ gmail.com).
FACSAria II (Special order unit) | BD Biosciences | – | Other cell sorters should work for this procedure. The key factors are: (1) a laser/detection system for the fluorescent reporter being used (488nm laser to excite EGFP in our case), (2) the ability to sort single events, (3) the ability to sort onto microscope slides for assessing the sort quality and (4) the ability to sort onto petri dishes (which may need |
Automated Cell Deposition Unit (for FACSAria II) | BD Biosciences | 643155 (if purchased separately from the FACSAria instrument) | |
Zymolyase 100T | Seikagaku Biobusiness | ||
G418 | A.G. Scientific | http://www.agscientific.com/molecular-biology/gene-expression/g-418-sulfate-solid.html |