Serbest hareket eden farede eş zamanlı odaklanmış ultrason nöromodülasyonu ve fiber fotometri kaydı

Tüm prosedürler ve hayvan muamelesi, NSFC etik yönergelerine ve Guangdong İstihbarat Bilimi ve Teknolojisi Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi’nin onaylanmış protokol gerekliliklerine uygundur. 1. Dönüştürücü hazırlığı İç çapı 3 mm, dış çapı 7 mm ve merkez frekansı 500 kHz olan bir piezoelektrik plaka hazırlayın.NOT: Dış çap, hedeflenen spesifik beyin bölgesine göre ayarlanabilir ve stimülasyon doğruluğunu korurken ve fare kafatasının sınırını aşmadan maksimize edilmelidir. Epoksi gümüş macunu kullanarak teli piezoelektrik plakanın iki tarafına takın (Şekil 1). Epoksi gümüş macunu katılaştıktan sonra, yaklaşık 0 olduğundan emin olmak için telin her iki ucundaki direnci ölçmek için bir multimetre kullanın. Temiz bir cam levha yüzeyine bir kat çift taraflı bant uygulayın. Yüksekliği 8 mm, dış çapı 8 mm ve iç çapı 7,6 mm olan piezoelektrik plakaya ve bakır halkaya cam levhaya sıkıca yapıştırın.NOT: Bakır halkanın iç çapı, plakanın bakır halka tarafından kaplandığından emin olmak için piezoelektrik plakanın boyutuna göre belirlenir. Dış çapı 3 mm olan polipropilen boruyu piezoelektrik plakanın ortasına güvenli bir şekilde yerleştirin ve cam levhaya sıkıca yapıştırın (Şekil 1). Uygun miktarda epoksi reçine yapıştırıcısı hazırlayın ve vakumlayın. Tek kullanımlık bir şırınga kullanarak epoksiyi çıkarın ve yavaşça bakır halkaya enjekte edin. Epoksi katılaşana kadar yaklaşık 10 saat bekleyin (Şekil 1). Elektronik bir havya kullanarak iki telin gevşek uçlarını bayonet somun konektörüne lehimleyin. Cam levhayı çıkarın. Dönüştürücünün yüzeyini alkolle temizleyin (Şekil 1). 2. FUN için raporlama parametreleri Hidrofonu ve dönüştürücüyü deiyonize su ile dolu bir su tankına yerleştirin (Şekil 2A). Konumlandırma sisteminin merkezi ışınının (Z ekseni) dönüştürücü ekseni ile hizalandığından emin olun. Bu hizalama, ilk olarak, 2D tarama yoluyla odak düzleminde bir maksimum alan keşfedilerek elde edilebilir; ikincisi, net bir maksimuma sahip başka bir düzlemde bir alan maksimumunun belirlenmesi; üçüncü olarak, iki maksimumun X ve Y koordinatlarını karşılaştırmak ve ardından gerekirse dönüştürücünün konumunu ve/veya yönünü yinelemeli olarak ayarlamak28. Hidrofonun ucunu, dönüştürücünün yüzeyi ile 1 mm’lik bir mesafede ayarlayın, hidrofonu dönüştürücünün sağ kenarının ortasına yerleştirirken bu mesafeyi sabit tutun. XZ düzlemindeki serbest akustik alanı yakalamak için tarama programını başlatın (Şekil 2B).NOT: Hidrofonun yapım yöntemi şu adreste bulunabilir: https://github.com/HQArrayLab/Hydrophone_system_control. Uzamsal tepe basıncıyla ilişkili derinlikleri belirlemek için hidrofonu Z ekseni boyunca hareket ettirin. Bu deneyde, uzamsal tepe basıncı, dönüştürücünün yüzeyinden 3,4 mm uzaklıkta görünür; hidrofonu XY düzleminde dönüştürücünün sağ alt köşesine hareket ettirirken bu mesafeyi koruyun. XY düzlemindeki serbest akustik alanı yakalamak için tarama programını çalıştırın ve başlatın (Şekil 2B). Dönüştürücüyü, 4. adımda anlatıldığı gibi ameliyat geçirmiş bir farenin kafatasına yerleştirin. XZ düzleminde ve XY düzleminde (Şekil 2D) transkraniyal akustik alanı 2.1-2.3’te açıklandığı gibi hidrofon taraması yoluyla elde edin. Serbest akustik alan ve transkraniyal akustik alandaki uzamsal tepe bölgesi olan odak noktasındaki basınç genliklerini okuyun. Serbest akustik alanda odak noktasındaki basınç genliği 730k Pa ve transkraniyal akustik alanda 580k Pa’dır. Bu dönüştürücünün akustik alanının hedef beyin alanlarını kapsayıp kapsayamayacağını değerlendirmek için -3 dB’deki odak boyutlarını (Şekil 2C,E) ve transkraniyal akustik alan içindeki XY ve XZ düzlemleri üzerindeki konumu okuyun. Kavitasyonu azaltmak için FDA kılavuz belgesi tarafından 1.9’un altında olacak şekilde sınırlandırılan Mekanik İndeks’i (MI) hesaplayın. MI’nın hesaplanması şu denklemle verilir:(1)burada pr,.3 , 0.3 dB cm-1 MHz-1’lik bir zayıflama katsayısı ile ayarlanan MPa cinsinden tepe-seyrekleşme basıncını temsil eder ve f0 , MHz cinsinden çalışma frekansıdır. Ölçülen transkraniyal alan tepe seyrekleşme basıncı, dönüştürücüden 3.4 mm uzaklıktaki 580 kPa, f0 500 kHz’dir, bu nedenle değeri düşmüş pr,.3 576.6 kPa’dır. MI 0.82’dir. FDA kılavuz belgesine göre düzlem yönünde 190 W/cm2’nin altında olması gereken uzamsal tepe nabız ortalama yoğunluğunu (Isppa) hesaplayın. Yoğunluğun hesaplanması şu denklemle verilir:(2)burada psp (t) uzamsal tepe konumunda zamanla değişen akustik basınçtır, Z ortamın karakteristik akustik empedansıdır (yaklaşık 1.Yumuşak doku için 5 x 106 Rayl) ve PD nabız süresidir. Kare zarf söz konusu olduğunda, bu denkleme indirgenir:(3)burada A, uzamsal tepe basınç genliğidir. Ultrason odaklı konumda ölçülen A 580 kPa’dır ve beynin Z’si yaklaşık 1.58 x 106 Rayls’tir, bu nedenle kare zarfın Isppa’sı 10.65 W/cm2 ve sinüzoidal zarfın Ispa’sı 10.65 W/cm2’dir. FDA kılavuz belgesi tarafından düzlem yönünde 430 mW/cm2’nin altında olacak şekilde sınırlandırılan uzamsal tepe zaman-ortalama yoğunluğunu (Ispta) hesaplayın. Yoğunluğun hesaplanması şu denklemle verilir:(4)burada T, ortalamanın hesaplandığı zaman periyodudur. Kare zarf söz konusu olduğunda, bu denkleme indirgenir:(5)DCdarbe treni , darbenin görev döngüsüdür. Burada, sürekli dalgalar kullanıldığı için DC darbe dizisi %1’dir, bu nedenle Ispta, kare bir zarf için uzamsal tepe darbe ortalama yoğunluğuna, 106.5 mW/cm2’ye eşittir. MI, Isppa ve Ispta yazılım kullanılarak hesaplanabilir (Şekil 3A). Kolay kullanım için MATLAB tabanlı bir kod https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation adresinde bulunabilir. Amaksimum, darbe süresi, darbe tekrarlama aralığı, darbe dizisi süresi ve zarf dahil olmak üzere darbe zamanlama parametrelerini bildirin (Şekil 3B). 3. Hayvanın ameliyata hazırlanması Yaklaşık ağırlığı yaklaşık 20 g olan 8 haftalık erkek GCaMP6s transgenik fareler ağırlığında. Steril salin içinde 10 mg / mL’de ketamin ve 2 mg / mL’de ksilazin içeren bir çözelti hazırlayın. Ketamin / ksilazin çözeltisini, 26G iğne ve 1 mL tek kullanımlık şırınga kullanarak 100 mg / kg ketamin ve 20 mg / kg ksilazin dozunda intraperitoneal enjeksiyon ile uygulayın. Hayvan, ayak parmağını çimdikleme gibi ağrılı uyaranlara yanıt vermediğinde cerrahi hazırlığa başlayın. Hayvanın kafasındaki tüyleri kesmek için bir fader kullanın ve cerrahi işlemden önce alanı etanol ve povidon-iyot ile dezenfekte edin. Fareyi stereotaksik çerçeve üzerinde yüzüstü pozisyona getirin ve kafatasının düz olduğundan emin olun. Nemi korumak için hayvanın gözlerinin üzerine koruyucu bir oftalmik merhem sürün. 4. Cerrahi prosedür Oksipital kemikten başlayarak burun kemiğinin başlangıcına kadar sagital sütür boyunca bir kesi yapın. Her iki yarım küreyi kaplayan cildi çıkarmak için cerrahi makas kullanın. Kafatasını temizlemek ve kalan periosteuumu ortadan kaldırmak için steril salin kullanın. Mikro gözenekler oluşturmak için yaklaşık 2 s-3 saniye boyunca pamuklu çubuk kullanarak açıkta kalan kafatasına% 3 hidrojen peroksit uygulayın. Steril tuzlu su ile iyice durulayın ve alanın tamamen kuru olduğundan emin olun. Bregma ve lambda ile hizalanmış stereotaksik atlas tarafından belirlenen beyin alanı konumunun üzerinde steril, otoklavlı bir matkap ucu kullanarak 0,6 mm çapında bir çapak deliği kraniyotomi oluşturun. Kalıntıları steril tuzlu suyla yıkayın ve iyice kurumasını sağlayın. Herhangi bir dokuya zarar vermemeye dikkat edin. Fiber optik yüksüğü (implant) prob tutucuya yerleştirin ve stereotaksik kola bağlayın. Stereotaksik kolu kullanarak implantı doğrudan ilgilenilen bölgenin üzerine hizalayın. Optik fiberi beyin dokusuna yerleştirirken, fiberi yaklaşık 2 mm/dk hızında yavaşça ilerletin. Kafatası boyunca kolay uygulama sağlayan bir viskozite elde etmek için diş çimentosunu karıştırın. Kafatası üzerine ve implantın alt kısmına ince bir diş çimentosu tabakası yaymak için steril bir kürdan kullanın. Tamamen kurumasını bekleyin. Prob tutucuyu dikkatli bir şekilde ayırın. 3 mm yüksekliğinde, dış çapı 3 mm ve iç çapı 2,6 mm olan bir polipropilen boru hazırlayın ve ardından boruyu uzunluğu boyunca kesin. Boruyu cımbız kullanarak implantın altına takın. Fiber optik sinyali kaydetmek için implantın üzerinde yeterli uzunluk sağlayarak diş çimentosu tozunu boruya dökün. Gerekli sıvıyı ekleyin ve diş çimentosunun katılaşması için birkaç dakika bekleyin. Borunun açıklığını bulun ve cımbız kullanarak boruyu çıkarmak için dikkatlice sıkıştırın. Diş çimentosu karışımını uygulama için hazırlayın, kafatası boyunca eşit ve ince bir tabaka yayılmasını sağlayın. Kafatası üzerinde mümkün olduğunca fazla yüzey alanını diş çimentosu ile kaplayın. Diş çekirdeğinin katılaşması için birkaç dakika bekleyin.NOT: Diş çimentosunun farenin derisi ile temas etmesine izin vermeyin. 3D baskılı halkaya, ufukta eşit olarak bölünmüş, 7 mm yüksekliğinde, dış çapı 10 mm ve iç çapı 8,4 mm olan üç delik (1 mm çapında) açın. Vidaları (1 mm uzunluğunda) ilgili deliklerine sabitleyin. İmplantın üst kısmını önceden üretilmiş dönüştürücünün deliğine yerleştirin. 3D yazdırılmış halkanın iç duvarının pürüzsüz olduğundan emin olun ve ardından fare kafatası üzerine yerleştirilmiş dönüştürücünün etrafına yerleştirin. Dönüştürücünün halka içinde ortalandığından emin olun. Halka ile kafatası arasındaki bağlantıya diş çimentosu uygulayın, ardından diş çimentosunun katılaşması için birkaç dakika bekleyin. Diş çimentosunu dönüştürücü ile kafatası arasındaki bağlantıya yerleştirmekten kaçının. Dönüştürücüyü dikkatlice çıkarın ve vidaları iyice sıkın. Fareyi sıcak bir kafese aktarın ve orijinal kafesine geri koymadan önce tamamen iyileşene kadar izlendiğinden emin olun. Ameliyattan sonra, analjezi için deri altı Carprofen (2 mg / kg) uygulayın ve iltihabı ve ağrıyı yönetmek için her 24 saatte bir 3 gün boyunca devam edin. Hayvanları herhangi bir sıkıntı, anormal kilo kaybı, ağrı veya enfeksiyon belirtisi açısından günlük olarak izleyin. Normalde, ameliyattan sonraki 3. güne kadar , tüm fareler normal davranış sergilemelidir. 3. günden sonra bir farede herhangi bir sıkıntı veya hastalık belirtisi gözlenirse, ötenazi için kurumsal yönergeleri izleyin. 5. Stimülasyon ve sinyal kaydı Ameliyattan 7 gün sonra, gaz anestezi makinesine giden oksijen beslemesini açın ve gaz akışını 300-500 mL / dk’ya ayarlamak için oksijen akış regülatörünü ayarlayın. Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin ve maskeye giden anestezik gaz dağıtımını kapatın. Uygun anestezik konsantrasyonu (%2 – %2,5) ayarlamak için buharlaştırıcı kadranını çevirin. Fare uyuşturulduktan sonra, anestezik bir maske ile stereotaksik çerçeveye yerleştirin. Anestezik gazın anestezik maskeye akmasına izin vermek için indüksiyon hattını kapatın. Uygun idame anestezik konsantrasyonunu ayarlayın (% 1 -% 1.5). İmplantın üst yüzeyini alkolle temizleyin ve ardından fiber optik yama kablosunu hazırlanan dönüştürücünün ortasına yerleştirin. Kafatasını nemlendirmek için 26G iğne ve 1 mL tek kullanımlık şırınga kullanarak implant ile 3D baskılı halka arasındaki boşluğa su enjekte edin. Fazla suyu emmek için kağıt havlu kullanın. Ultrasonun dönüştürücüden beyne kolay yayılmasını kolaylaştırmak için 26G iğne ve 1 mL tek kullanımlık şırınga kullanarak implant ile 3D baskılı halka arasındaki boşluğa bir birleştirme maddesi enjekte edin. İmplantı fiber optik yama kablosuna bağlayın. Dönüştürücüyü bir birleştirme maddesi ile doldurulmuş alana dikkatlice yerleştirin ve vidaları güvenli bir şekilde sıkın. Fareyi açık bir alana yerleştirin ve uyanmasına izin verin. Dönüştürücüyü ultrasonik uyarma sistemine takın ve fiber optik yama kablosunu fiber optik kayıt sistemine bağlayarak fare için hareket özgürlüğü sağlayın.NOT: Fiber optik patch kablonun uzunluğu 2m ve çapı 1.25 mm’dir. 405 kanalı için ışık yoğunluğu 20 μW ve 470 kanalı için 40 μW’dir. Ultrasonik nöral modülasyonu fiber optik sinyal kaydı ile senkronize etmek için hem ultrasonik uyarma cihazını hem de fiber optik kayıt sistemini etkinleştirin.