נוירומודולציית אולטרסאונד ממוקדת בו זמנית והקלטת פוטומטריית סיבים בעכבר הנע בחופשיות

כל הנהלים והטיפול בבעלי חיים עמדו בהנחיות האתיקה של NSFC ובדרישות פרוטוקול מאושרות של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מכון גואנגדונג למודיעין, מדע וטכנולוגיה. 1. הכנת מתמרים הכינו צלחת פיאזואלקטרית בקוטר פנימי של 3 מ”מ, קוטר חיצוני של 7 מ”מ ותדר מרכזי של 500 קילוהרץ.הערה: ניתן לכוונן את הקוטר החיצוני בהתבסס על האזור הספציפי במוח הממוקד ויש למקסם אותו תוך שמירה על דיוק הגירוי ומבלי לחרוג מגבול גולגולת העכבר. חברו את החוט לשני הצדדים של הלוח הפיזואלקטרי באמצעות משחת כסף אפוקסי (איור 1). לאחר שמשחת הכסף האפוקסי התמצקה, השתמש במולטימטר כדי למדוד את ההתנגדות בשני קצוות החוט כדי לוודא שהיא בערך 0. יש למרוח שכבה של סרט דו-צדדי על משטח זכוכית נקי. היצמדו לצלחת הפיזואלקטרית ולטבעת הנחושת, בגובה של 8 מ”מ, קוטר חיצוני של 8 מ”מ וקוטר פנימי של 7.6 מ”מ, צמוד ליריעת הזכוכית.הערה: הקוטר הפנימי של טבעת הנחושת נקבע על ידי גודל הלוח הפיזואלקטרי כדי להבטיח שהלוח מכוסה על ידי טבעת הנחושת. הכניסו היטב את צינור הפוליפרופילן בקוטר חיצוני של 3 מ”מ למרכז הלוח הפיזואלקטרי והדביקו אותו היטב ליריעת הזכוכית (איור 1). הכינו כמות מתאימה של דבק שרף אפוקסי ושאבו אותו. מוציאים את האפוקסי בעזרת מזרק חד פעמי ומזריקים אותו לאט לאט לתוך טבעת הנחושת. המתינו כ-10 שעות עד שהאפוקסי יתמצק (איור 1). הלחמת את הקצוות הרופפים של שני חוטים על מחבר אום הכידון באמצעות מגהץ הלחמה אלקטרוני. הסירו את יריעת הזכוכית. נקו את פני השטח של המתמר עם אלכוהול (איור 1). 2. פרמטרי דיווח עבור FUN הניחו את ההידרופון והמתמר במיכל מים מלא במים שעברו דה-יוניזציה (איור 2A). ודא שהקרן המרכזית (ציר Z) של מערכת המיקום מיושרת עם ציר המתמר. יישור זה יכול להיות מושג על ידי ראשית, גילוי שדה מקסימלי במישור המוקד באמצעות סריקה דו-ממדית; שנית, זיהוי שדה מקסימלי במישור אחר עם מקסימום ברור; שלישית, השוואת קואורדינטות X ו- Y של שתי המקסימום ולאחר מכן התאמה איטרטיבית של המיקום ו / או הכיוון של המתמר במידת הצורך28. כוונן את קצה ההידרופון עם פני השטח של המתמר במרחק של 1 מ”מ, תוך שמירה על מרחק קבוע תוך מיקום ההידרופון באמצע הקצה הימני של המתמר. הפעל את תוכנית הסריקה כדי ללכוד את השדה האקוסטי החופשי במישור XZ (איור 2B).הערה: ניתן למצוא את שיטת הבנייה של ההידרופון https://github.com/HQArrayLab/Hydrophone_system_control. הזיזו את ההידרופון לאורך ציר Z כדי לקבוע את העומקים הקשורים ללחץ השיא המרחבי. בניסוי זה, לחץ השיא המרחבי מופיע במרחק של 3.4 מ”מ מפני השטח של המתמר; שמור על מרחק זה בעת הזזת ההידרופון לפינה הימנית התחתונה של המתמר במישור XY. הפעל והפעל את תוכנית הסריקה כדי ללכוד את השדה האקוסטי החופשי במישור XY (איור 2B). הניחו את המתמר על גולגולת של עכבר שעבר ניתוח כמתואר בשלב 4. רכשו את השדה האקוסטי הטרנס-גולגולתי במישור XZ ובמישור XY (איור 2D) באמצעות סריקה הידרופונית כמתואר ב-2.1-2.3. קרא את אמפליטודות הלחץ בנקודת המוקד, שהיא אזור השיא המרחבי בשדה האקוסטי החופשי ובשדה האקוסטי הטרנס-גולגולתי. משרעת הלחץ בנקודת המוקד בשדה האקוסטי החופשי היא 730k Pa, ובשדה האקוסטי הטרנס-גולגולתי היא 580k Pa. קראו את ממדי המוקד ב-3- dB (איור 2C,E), ואת המיקום במישורי XY ו-XZ בתוך השדה האקוסטי הטרנס-גולגולתי כדי להעריך אם השדה האקוסטי של המתמר הזה יכול לכסות את אזורי המטרה במוח. חשב את המדד המכני (MI), אשר מוגבל על ידי מסמך הנחיות ה- FDA להיות מתחת 1.9 על מנת להפחית cavitation. חישוב MI נתון על ידי המשוואה:(1)כאשר pr,.3 מייצג את שיא הלחץ הרפרפקציוני ב- MPa המותאם על ידי מקדם הנחתה של 0.3 dB cm-1 MHz-1, ו – f0 הוא תדר הפעולה ב- MHz. הלחץ הרפרפקציוני של שיא השדה הטרנס-גולגולתי שנמדד הוא 580 kPa, , 3.4 מ”מ מהמתמר, f0 הוא 500 kHz, כך שה- pr,.3 המנוטרל הוא 576.6 kPa. ה-MI הוא 0.82. חשב את עוצמת הדופק הממוצעת של שיא מרחבי (Isppa), הנדרשת להיות מתחת ל -190 W/cm2 בכיוון המישור על פי מסמך הנחיות ה- FDA. חישוב העוצמה נתון על ידי המשוואה:(2)כאשר psp (t) הוא הלחץ האקוסטי המשתנה בזמן במיקום הפסגה המרחבית, Z הוא העכבה האקוסטית האופיינית של התווך (בערך 1.5 x 106 קרניים לרקמות רכות), ופרקינסון הוא משך הדופק. במקרה של המעטפה הריבועית, זה מצטמצם למשוואה:(3)כאשר A היא משרעת הלחץ המרחבית-שיא. ה-A שנמדד במיקום ממוקד האולטרסאונד הוא 580 kPa, וה-Z של המוח הוא בערך 1.58 x 106 קרניים, כך שה-Isppa של המעטפת הריבועית הוא 10.65 W/cm2 וה-Isppa של המעטפת הסינוסואידית הוא 10.65 W/cm2. חשב את העוצמה המרחבית-שיא הזמן-ממוצעת (Ispta), אשר מוגבלת על ידי מסמך ההנחיות של ה- FDA להיות מתחת 430 mW / cm2 בכיוון המטוס. חישוב העוצמה נתון על ידי המשוואה:(4)כאשר T הוא פרק הזמן שבו מחושב הממוצע. במקרה של המעטפה הריבועית, זה מצטמצם למשוואה:(5)כאשררכבת דופק DC היא מחזור העבודה של הדופק. כאן, רכבת הדופק DC היא 1% מכיוון שנעשה שימוש בגלים רציפים, כך שה- I spta שווה לעוצמת הדופק הממוצעת של שיא מרחבי, 106.5 mW / cm2 עבור מעטפת מרובעת. ניתן לחשב את MI, Isppa ו-Ispta באמצעות התוכנה (איור 3A). קוד מבוסס MATLAB לשימוש קל ניתן למצוא בכתובת https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation. דווחו על פרמטרי תזמון הדופק, כולל Aמקסימום, משך הדופק, מרווח חזרת הדופק, משך רכבת הדופק והמעטפה (איור 3B). 3. הכנת החיה לניתוח שוקלים עכברים טרנסגניים זכרים בני 8 שבועות מסוג GCaMP6s, שמשקלו משוער הוא כ-20 גרם. הכינו תמיסה המכילה קטמין ב-10 מ”ג/מ”ל וקסילזין ב-2 מ”ג/מ”ל במי מלח סטריליים. יש לתת את תמיסת הקטמין/קסילזין בהזרקה תוך צפקית במינון של 100 מ”ג/ק”ג קטמין ו-20 מ”ג/ק”ג קסילזין באמצעות מחט 26 גרם ומזרק חד פעמי בנפח 1 מ”ל. התחל הכנה כירורגית ברגע שבעל החיים אינו מגיב לגירויים כואבים, כגון צביטת בוהן. השתמש fader כדי לקצץ את השיער על הראש של החיה ולחטא את האזור עם 70% אתנול ו povidone-יוד לפני ההליך הכירורגי. מקם את העכבר במצב נוטה על המסגרת הסטריאוטקסית וודא שהגולגולת ישרה. הניחו משחת עיניים מגנה על עיני בעל החיים כדי לשמור על לחות. 4. הליך כירורגי בצע חתך לאורך התפר sagittal, החל מן העצם העורפית לתחילת עצם האף. השתמש מספריים כירורגיים כדי להסיר את העור המכסה את שתי ההמיספרות. השתמש מלוחים סטריליים כדי לנקות את הגולגולת ולחסל כל periosteum שנותר. יש למרוח 3% מי חמצן על הגולגולת החשופה באמצעות צמר גפן למשך כ-2-3 שניות ליצירת מיקרו-נקבוביות. יש לשטוף היטב במי מלח סטריליים ולוודא שהאזור יבש לחלוטין. צור קרניוטומיה של חור בור בקוטר 0.6 מ”מ באמצעות מקדח סטרילי ואוטוקלאבי מעל מיקום אזור המוח כפי שנקבע על ידי האטלס הסטריאוטקסי המיושר לברגמה וללמדא. שטפו את כל הלכלוך במי מלח סטריליים והבטיחו ייבוש יסודי. היזהר לא לפגוע בשום רקמה. הכנס את הסיב האופטי (שתל) למחזיק הבדיקה וחבר אותו לזרוע הסטריאוטקסית. יישרו את השתל ישירות מעל אזור העניין באמצעות הזרוע הסטריאוטקסית. בעת החדרת הסיב האופטי לרקמת המוח, יש לקדם את הסיב באיטיות בקצב של כ-2 מ”מ/דקה. ערבבו את הצמנט הדנטלי כדי להשיג צמיגות המאפשרת מריחה קלה על פני הגולגולת. השתמש בקיסם סטרילי כדי לפזר שכבה דקה של מלט דנטלי על הגולגולת ועל החלק התחתון של השתל. הניחו לו להתייבש לחלוטין. נתק את בעל הבדיקה בזהירות. הכינו צינור פוליפרופילן בגובה של 3 מ”מ, קוטר חיצוני של 3 מ”מ וקוטר פנימי של 2.6 מ”מ, ולאחר מכן חתכו את הצינור לכל אורכו. חברו את הצינור לתחתית השתל באמצעות פינצטה. שפכו את אבקת המלט הדנטלית לתוך הצינור כדי להבטיח אורך מספיק מעל השתל להקלטת אות הסיב האופטי. מוסיפים את הנוזל הדרוש ומאפשרים מספר דקות עד שהמלט הדנטלי יתמצק. אתר את פתח הצינור ומהדק אותו בזהירות כדי להסיר את הצינור באמצעות פינצטה. הכינו את תערובת הצמנט הדנטלי למריחה, וודאו ששכבה אחידה ודקה נפרסת על פני הגולגולת. כסו שטח פנים רב ככל האפשר על הגולגולת במלט דנטלי. המתן מספר דקות עד שבית הקברות הדנטלי יתמצק.הערה: אין לתת למלט הדנטלי לבוא במגע עם עור העכבר. קדחו שלושה חורים (קוטר 1 מ”מ) לתוך הטבעת המודפסת בתלת-ממד, מחולקת באופן שווה באופק, בגובה של 7 מ”מ, קוטר חיצוני של 10 מ”מ וקוטר פנימי של 8.4 מ”מ. אבטחו את הברגים (באורך 1 מ”מ) לתוך החורים שלהם. הכנס את החלק העליון של השתל לתוך החור של המתמר שיוצר מראש. ודא שהדופן הפנימית של הטבעת המודפסת בתלת-ממד חלקה, ולאחר מכן מקם אותה סביב המתמר הממוקם על גולגולת העכבר. ודא שהמתמר ממורכז בתוך הטבעת. מרחו צמנט דנטלי על הצומת שבין הטבעת לגולגולת, ואז המתינו מספר דקות עד שהמלט הדנטלי יתמצק. הימנעו מהנחת המלט הדנטלי על החיבור בין המתמר לגולגולת. הסר בזהירות את המתמר והדק היטב את הברגים. העבירו את העכבר לכלוב חם וודאו שהוא מנוטר עד להחלמה מלאה לפני החזרתו לכלוב המקורי. לאחר הניתוח, לנהל Carprofen תת עורית (2 מ”ג / ק”ג) עבור שיכוך כאבים ולהמשיך כל 24 שעות במשך 3 ימים כדי לנהל דלקת וכאב. יש לעקוב אחר בעלי החיים מדי יום לאיתור סימני מצוקה, ירידה חריגה במשקל, כאב או זיהום. בדרך כלל,עד היום השלישי לאחר הניתוח, כל העכברים צריכים להפגין התנהגות נורמלית. אם סימני מצוקה או מחלה כלשהם נצפים בעכבר לאחר היוםהשלישי , פעל בהתאם להנחיות המוסדיות להמתת חסד. 5. גירוי והקלטת אותות לאחר 7 ימים לאחר הניתוח, הפעל את אספקת החמצן למכונת הרדמת הגז וכוונן את וסת זרימת החמצן כדי להגדיר את זרימת הגז ל 300-500 מ”ל / דקה. הניחו את העכבר בתא האינדוקציה וסגרו את הזרמת גז ההרדמה למסכה. סובב את חוגת הוופורייזר כדי להתאים את ריכוז ההרדמה המתאים (2%-2.5%). לאחר שהעכבר מורדם, הניחו אותו על המסגרת הסטריאוטקסית עם מסכת הרדמה. סגור את קו הזירוז כדי לאפשר לגז ההרדמה לזרום לתוך מסיכת ההרדמה. התאמת ריכוז ההרדמה התחזוקתית המתאימה (1%-1.5%). נקו את המשטח העליון של השתל באלכוהול, ולאחר מכן הכניסו את כבל התיקון של הסיב האופטי למרכז המתמר המוכן. הזריקו מים לרווח שבין השתל לטבעת המודפסת בתלת-ממד באמצעות מחט 26G ומזרק חד פעמי בנפח 1 מ”ל כדי להרטיב את הגולגולת. השתמשו במגבות נייר כדי לספוג עודפי מים. הזריקו חומר צימוד לחלל שבין השתל לטבעת המודפסת בתלת-ממד באמצעות מחט 26G ומזרק חד פעמי בנפח 1 מ”ל כדי להקל על התפשטות קלה של אולטרסאונד מהמתמר למוח. חבר את השתל לכבל התיקון של הסיב האופטי. הכניסו בזהירות את המתמר לאזור המלא בחומר צימוד והדקו היטב את הברגים. מקם את העכבר בשדה פתוח ואפשר לו להתעורר. חבר את המתמר למערכת העירור העל-קולי וחבר את כבל התיקון של הסיב האופטי למערכת הקלטת הסיב האופטי, מה שמאפשר חופש תנועה לעכבר.הערה: כבל התיקון של הסיב האופטי הוא באורך של 2 מ’ וקוטר של 1.25 מ”מ. עוצמת האור עבור ערוץ 405 היא 20 μW, ועבור ערוץ 470 היא 40 μW. הפעל הן את מכשיר העירור העל-קולי והן את מערכת הקלטת הסיב האופטי על מנת לסנכרן אפנון עצבי על-קולי עם הקלטת אות סיב אופטי.