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Neuroscience

Gleichzeitige fokussierte Ultraschall-Neuromodulation und Faserphotometrie-Aufzeichnung in frei beweglichen Mäusen

Published: September 06, 2024
doi:
10.3791/67090
, , , , , , , ,
1Guangdong Institute of Intelligence Science and Technology, 2School of Microelectronics,Xidian University, 3Department of Biomedical Engineering,The Hong Kong Polytechnic University, 4Centre for Cognitive and Brain Sciences and Ministry of Education Frontiers Science Center for Precision Oncology,University of Macau, 5Deep Brain Technology Co., Ltd

Summary

Das Protokoll umfasst die Herstellung von Schallköpfen, die Parameterberichterstattung, den chirurgischen Eingriff und die Signalaufzeichnung für den gesamten operativen Arbeitsablauf der gleichzeitigen fokussierten Ultraschall-Neuromodulation und der Faserphotometrie-Aufzeichnung bei frei beweglichen Mäusen.

Abstract

Die fokussierte Ultraschall-Neuromodulation (FUN) stellt einen vielversprechenden Ansatz zur nicht-invasiven Störung neuronaler Schaltkreise in tiefen Hirnregionen dar. Es ist mit den meisten bestehenden Modalitäten zur Überwachung von Gehirnfunktionen in vivo kompatibel. Die Integration mit Modalitäten zur Aufzeichnung von Gehirnfunktionen ermöglicht es uns nicht nur, Ordnungen und Störungen bestimmter Gehirnfunktionen mit Closed-Loop-Feedback zu adressieren, sondern liefert uns auch mechanistische Einblicke in FUN selbst. Hier stellen wir ein modifiziertes, einfaches, zuverlässiges und robustes Protokoll für die gleichzeitige Anwendung von FUN- und Faserphotometrie GCaMP6s Fluoreszenzaufzeichnung bei frei beweglichen Mäusen zur Verfügung. Dies beinhaltet die Herstellung eines gut dimensionierten Einzelwandlers und dessen vorübergehende Platzierung auf den Mäusen, zusammen mit der sicheren Fixierung eines faseroptischen Implantats, um den reibungslosen Durchgang des Schallkopfs zu erleichtern. Die Kombination von FUN und Faserphotometrie ermöglicht die optische Aufzeichnung von neuronalen Schaltkreisantworten auf FUN in Echtzeit in tiefen Hirnregionen. Um die Effizienz dieses Protokolls zu demonstrieren, wurden Thy1-GCaMP6s-Mäuse als Beispiel verwendet, um die Neuroaktivität im vorderen Thalamuskern während FUN aufzuzeichnen, während sich die Mäuse frei bewegen. Wir glauben, dass dieses Protokoll die breite Anwendung von FUN sowohl im Bereich der Neurowissenschaften als auch im Bereich des biomedizinischen Ultraschalls fördern kann.

Introduction

Die fokussierte Ultraschall-Neuromodulation (FUN) hat sich als vielversprechendes und vielseitiges Neuromodulationswerkzeug herausgestellt, das die Erforschung der Gehirnfunktion und -organisation mit großem Potenzial ermöglicht1. FUN ist in der Lage, akustische Energie nicht-invasiv und punktgenau an jede Position im Hirngewebe abzugeben2. Seine Fähigkeit, die Neuroaktivität in der tiefen Hirnstruktur mit hoher raumzeitlicher Spezifität auf sichere und nicht-invasive Weise vorübergehend und reversibel zu modulieren, stellt ein attraktives Attribut dar, das die bestehende klinische Neuromodulationstechnikergänzt 3. Der Nachweis eines effektiven FUN wurde sowohl bei menschlichen Probanden 4,5,6 als auch bei verschiedenen Tiermodellen bestätigt, die kleine 7,8,9,10 und große Arten 11,12,13,14,15,16,17 umfassen.

Durch die Beobachtung der Wirkung von FUN auf bestimmte neuronale Typen durch Neuroaktivitätsüberwachung während FUN können wir den Mechanismus hinter diesem Prozess untersuchen18,19. Die Faserphotometrie auf der Grundlage genetisch kodierter Calciumindikatoren (GECIs) hat sich in den letzten zehn Jahren als vielseitige Methode zur Verfolgung der zelltypspezifischen Populationsaktivität in vivo durchgesetzt 20,21,22,23,24. Die gleichzeitige Anwendung von FUN und Faserphotometrie kann daher unser umfassendes Verständnis von FUN erheblich bereichern. Nichtsdestotrotz erfordert die Verwendung von sperrigen Einzelwandlern eine Fixierung an einem Rahmen, während die Tiere einer Anästhesie unterzogen und in einem stereotaktischen Rahmen immobilisiert werden müssen 7,19,25,26. Dieser Ansatz ist möglicherweise nicht für bestimmte Arten von Experimenten im Zusammenhang mit Wahrnehmung, Kognition und Verhaltensbewertung geeignet. Es ist von entscheidender Bedeutung, ein Protokoll zu etablieren, das die Verschmelzung von FUN- und Faserphotometrie erleichtert, ohne die Mobilisierung der Mäuse zu behindern7.

In dieser Studie stellen wir ein verfeinertes Protokoll vor, das in unseren früheren Studien verwendet wurde, um das Verfahren zur Herstellung eines einzelnen Schallkopfes und seiner vorübergehenden Fixierung auf den Mäusen sowie die sichere Fixierung eines faseroptischen Implantats zur Erleichterung des reibungslosen Durchgangs des Schallkopfs 7,19,26 nahtlos und elegant zu ergänzen . Es ermöglicht Forschern, die durch Ultraschall modulierte Neuroaktivität bei unkontrollierten Mäusen aufzuzeichnen. Wir haben uns für eine glattere Hüllkurve entschieden, z. B. eine sinusförmige Hüllkurve, um die auditive Verwirrung27 zu reduzieren. Die Machbarkeit dieses Protokolls wird durch die gleichzeitige Aufzeichnung der Neuroaktivität im vorderen Thalamuskern von sich frei bewegenden Mäusen während der FUN bestätigt. Es zeigt, dass die Energie des Schallkopfs ausreicht, um eine Neuromodulation zu erreichen, und dass die Fixierungsmethoden für das faseroptische Implantat und den Schallkopf ihre Stabilität gewährleisten können.

Protocol

Alle Verfahren und der Umgang mit den Tieren entsprachen den Ethikrichtlinien der NSFC und den genehmigten Protokollanforderungen des Institutional Animal Care and Use Committee des Guangdong Institute of Intelligence Science and Technology. 1. Vorbereitung des Wandlers Bereiten Sie eine piezoelektrische Platte mit einem Innendurchmesser von 3 mm, einem Außendurchmesser von 7 mm und einer Mittenfrequenz von 500 kHz vor.HINWEIS: Der Außendurchmesser kann basierend auf der spezifischen Gehirnregion, auf die abgestimmt wird, eingestellt werden und sollte bei gleichbleibender Stimulationsgenauigkeit und ohne Überschreitung der Grenze des Mausschädels maximiert werden. Befestigen Sie den Draht mit Epoxidsilberpaste an den beiden Seiten der piezoelektrischen Platte (Abbildung 1). Nachdem die Epoxidsilberpaste erstarrt ist, messen Sie mit einem Multimeter den Widerstand an beiden Enden des Drahtes, um sicherzustellen, dass er ungefähr 0 beträgt. Bringen Sie eine Schicht doppelseitiges Klebeband auf eine saubere Glasscheibenoberfläche an. Kleben Sie die piezoelektrische Platte und den Kupferring mit einer Höhe von 8 mm, einem Außendurchmesser von 8 mm und einem Innendurchmesser von 7,6 mm fest an die Glasscheibe.HINWEIS: Der Innendurchmesser des Kupferrings wird durch die Größe der piezoelektrischen Platte bestimmt, um sicherzustellen, dass die Platte vom Kupferring bedeckt ist. Führen Sie das Polypropylenrohr mit einem Außendurchmesser von 3 mm sicher in die Mitte der piezoelektrischen Platte ein und kleben Sie es fest mit der Glasscheibe (Abbildung 1). Bereiten Sie eine angemessene Menge Epoxidharzkleber vor und vakuumieren Sie ihn. Extrahieren Sie das Epoxidharz mit einer Einwegspritze und injizieren Sie es langsam in den Kupferring. Warten Sie ca. 10 h, bis sich das Epoxidharz verfestigt hat (Abbildung 1). Löten Sie die losen Enden von zwei Drähten mit einem elektronischen Lötkolben auf den Bajonettmutterstecker. Entfernen Sie die Glasscheibe. Reinigen Sie die Oberfläche des Schallkopfs mit Alkohol (Abbildung 1). 2. Berichtsparameter für FUN Stellen Sie das Hydrophon und den Wandler in einen Wassertank, der mit entionisiertem Wasser gefüllt ist (Abbildung 2A). Stellen Sie sicher, dass der Mittelbalken (Z-Achse) des Positioniersystems mit der Aufnehmerachse ausgerichtet ist. Diese Ausrichtung kann erreicht werden, indem erstens ein Feldmaximum in der Fokusebene durch 2D-Scannen entdeckt wird; zweitens die Identifizierung eines Feldmaximums in einer anderen Ebene mit einem klaren Maximum; drittens das Vergleichen der X- und Y-Koordinaten der beiden Maxima und das anschließende iterative Anpassen der Position und/oder Ausrichtung des Wandlers, fallserforderlich 28. Stellen Sie die Spitze des Hydrophons mit der Oberfläche des Wandlers in einem Abstand von 1 mm ein, wobei Sie diesen Abstand konstant halten, während Sie das Hydrophon in der Mitte der rechten Kante des Wandlers positionieren. Starten Sie das Scanprogramm, um das freie akustische Feld in der XZ-Ebene zu erfassen (Abbildung 2B).HINWEIS: Die Bauweise des Hydrophons finden Sie unter https://github.com/HQArrayLab/Hydrophone_system_control. Verschieben Sie das Hydrophon entlang der Z-Achse, um die Tiefen zu bestimmen, die dem räumlichen Spitzendruck zugeordnet sind. In diesem Experiment tritt der räumliche Spitzendruck in einem Abstand von 3,4 mm von der Oberfläche des Wandlers auf; Halten Sie diesen Abstand ein, wenn Sie das Hydrophon in die untere rechte Ecke des Wandlers in der XY-Ebene bewegen. Schalten Sie das Gerät ein und starten Sie das Scanprogramm, um das freie akustische Feld in der XY-Ebene zu erfassen (Abbildung 2B). Platzieren Sie den Schallkopf auf dem Schädel einer Maus, die wie in Schritt 4 beschrieben operiert wurde. Erfassen Sie das transkranielle akustische Feld auf der XZ-Ebene und der XY-Ebene (Abbildung 2D) durch Hydrophon-Scanning, wie in 2.1-2.3 beschrieben. Lesen Sie die Druckamplituden am Brennpunkt ab, der der räumliche Peakbereich im freien akustischen Feld und im transkraniellen akustischen Feld ist. Die Druckamplitude am Brennpunkt im freien Schallfeld beträgt 730 k Pa und im transkraniellen Schallfeld 580 k Pa. Lesen Sie die Fokusabmessungen bei -3 dB (Abbildung 2C, E) und die Position auf der XY- und XZ-Ebene innerhalb des transkraniellen Schallfeldes ab, um zu beurteilen, ob das Schallfeld dieses Schallkopfs die Zielbereiche des Gehirns abdecken kann. Berechnen Sie den mechanischen Index (MI), der durch den FDA-Leitfaden auf unter 1,9 begrenzt ist, um Kavitation zu verringern. Die Berechnung des MI ergibt sich aus der Gleichung:(1)wobei pr,.3 den Spitzenverdünnungsdruck in MPa darstellt, angepasst durch einen Dämpfungskoeffizienten von 0,3 dB cm-1 MHz-1, und f0 die Betriebsfrequenz in MHz ist. Der gemessene Spitzendruck im transkraniellen Feld beträgt 580 kPa, 3,4 mm vom Wandler entfernt , f0 beträgt 500 kHz, so dass die Leistungsminderung pr,.3 576,6 kPa beträgt. Der MI beträgt 0,82. Berechnen Sie die räumliche Spitzenpuls-Durchschnittsintensität (Isppa), die gemäß dem FDA-Leitliniendokument unter 190 W/cm2 in Ebenenrichtung liegen muss. Die Berechnung der Intensität ergibt sich aus der Gleichung:(2)wobei psp (t) der zeitlich veränderliche Schalldruck am Ort des räumlichen Peaks ist, Z die charakteristische akustische Impedanz des Mediums (ca. 1.5 x 106 Rayls für Weichgewebe), und PD ist die Pulsdauer. Im Fall der quadratischen Hüllkurve reduziert sich dies auf die Gleichung:(3)wobei A die räumliche Spitzendruckamplitude ist. Das A, das an der ultraschallfokussierten Stelle gemessen wird, beträgt 580 kPa, und das Z des Gehirns beträgt etwa 1,58 x 106 Rayls, so dass das Isppa der quadratischen Hülle 10,65 W/cm2 und das Isppa der sinusförmigen Hülle 10,65 W/cm2 beträgt. Berechnen Sie die räumlich-maximale zeitdurchschnittliche Intensität (Ispta), die durch das FDA-Leitliniendokument auf unter 430 mW/cm2 in Ebenenrichtung beschränkt ist. Die Berechnung der Intensität ergibt sich aus der Gleichung:(4)wobei T der Zeitraum ist, über den der Durchschnitt berechnet wird. Im Fall der quadratischen Hüllkurve reduziert sich dies auf die Gleichung:(5)wobei dieDC-Impulsfolge das Tastverhältnis des Impulses ist. Hier beträgt die DC-Impulsfolge 1 %, da kontinuierliche Wellen verwendet wurden, so dass der Ispta gleich der durchschnittlichen Intensität des räumlichen Spitzenpulses ist, 106,5 mW/cm2 für eine quadratische Hüllkurve. Der MI, Isppa und Ispta können mit der Software berechnet werden (Abbildung 3A). Einen MATLAB-basierten Code zur einfachen Bedienung finden Sie unter https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation. Melden Sie die Parameter des Puls-Timings, einschließlich Amax, Impulsdauer, Impulswiederholungsintervall, Impulsfolgedauer und Hüllkurve (Abbildung 3B). 3. Vorbereitung des Tieres auf die Operation Wiegen Sie 8 Wochen alte männliche GCaMP6s-transgene Mäuse mit einem ungefähren Gewicht von etwa 20 g. Bereiten Sie eine Lösung vor, die Ketamin in einer Menge von 10 mg/ml und Xylazin in einer Menge von 2 mg/ml in steriler Kochsalzlösung enthält. Verabreichen Sie die Ketamin/Xylazin-Lösung durch intraperitoneale Injektion in einer Dosierung von 100 mg/kg Ketamin und 20 mg/kg Xylazin mit einer 26-G-Nadel und 1 ml Einwegspritze. Beginnen Sie mit der chirurgischen Vorbereitung, sobald das Tier nicht mehr auf schmerzhafte Reize wie z. B. Zehenkneifen reagiert. Verwenden Sie einen Fader, um die Haare auf dem Kopf des Tieres zu trimmen und desinfizieren Sie den Bereich vor dem chirurgischen Eingriff mit 70% Ethanol und Povidon-Jod. Platzieren Sie die Maus in Bauchlage auf dem stereotaktischen Rahmen und stellen Sie sicher, dass der Schädel waagerecht ist. Tragen Sie eine schützende Augensalbe auf die Augen des Tieres auf, um die Feuchtigkeit zu erhalten. 4. Chirurgischer Eingriff Machen Sie einen Schnitt entlang der sagittalen Naht, beginnend vom Hinterhauptbein bis zum Anfang des Nasenbeins. Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um die Haut zu entfernen, die beide Hemisphären bedeckt. Verwenden Sie sterile Kochsalzlösung, um den Schädel zu reinigen und alle verbleibenden Knochenhaut zu entfernen. Tragen Sie 3% Wasserstoffperoxid mit einem Wattestäbchen für ca. 2 s-3 s auf den freiliegenden Schädel auf, um Mikroporen zu erzeugen. Spülen Sie gründlich mit steriler Kochsalzlösung ab und stellen Sie sicher, dass der Bereich vollständig trocken ist. Erstellen Sie eine Bohrlochkraniotomie mit einem Durchmesser von 0,6 mm mit einem sterilen, autoklavierten Bohrer über der Position des Gehirnbereichs, wie sie durch den stereotaktischen Atlas bestimmt wurde, der auf Bregma und Lambda ausgerichtet ist. Waschen Sie alle Rückstände mit steriler Kochsalzlösung ab und sorgen Sie für eine gründliche Trocknung. Achten Sie darauf, kein Gewebe zu beschädigen. Setzen Sie die faseroptische Ferrule (Implantat) in den Sondenhalter ein und verbinden Sie sie mit dem stereotaktischen Arm. Richten Sie das Implantat mit dem stereotaktischen Arm direkt über dem interessierenden Bereich aus. Wenn Sie die optische Faser in das Hirngewebe einführen, schieben Sie die Faser langsam mit einer Geschwindigkeit von ca. 2 mm/min voran. Mischen Sie den Zahnzement, um eine Viskosität zu erreichen, die ein einfaches Auftragen auf den Schädel ermöglicht. Verteilen Sie mit einem sterilen Zahnstocher eine dünne Schicht Zahnzement über den Schädel und auf den unteren Teil des Implantats. Lassen Sie es vollständig trocknen. Nehmen Sie den Sondenhalter vorsichtig ab. Bereiten Sie ein Polypropylenrohr mit einer Höhe von 3 mm, einem Außendurchmesser von 3 mm und einem Innendurchmesser von 2,6 mm vor und schneiden Sie das Rohr dann in seiner gesamten Länge ab. Befestigen Sie das Rohr mit einer Pinzette an der Unterseite des Implantats. Gießen Sie das Zahnzementpulver in das Rohr und stellen Sie sicher, dass die Länge über dem Implantat für die Aufzeichnung des Glasfasersignals ausreicht. Fügen Sie die erforderliche Flüssigkeit hinzu und lassen Sie den Zahnzement einige Minuten lang fest werden. Suchen Sie die Öffnung des Rohrs und klemmen Sie sie vorsichtig fest, um das Rohr mit einer Pinzette zu entfernen. Bereiten Sie die Zahnzementmischung für das Auftragen vor und stellen Sie sicher, dass eine gleichmäßige und dünne Schicht auf dem Schädel verteilt wird. Decken Sie so viel Oberfläche wie möglich auf dem Schädel mit Zahnzement ab. Warten Sie einige Minuten, bis sich der Zahnzemental verfestigt hat.HINWEIS: Lassen Sie den Zahnzement nicht mit der Haut der Maus in Berührung kommen. Bohren Sie drei Löcher (1 mm Durchmesser) in den 3D-gedruckten Ring, gleichmäßig am Horizont verteilt, mit einer Höhe von 7 mm, einem Außendurchmesser von 10 mm und einem Innendurchmesser von 8,4 mm. Befestigen Sie die Schrauben (1 mm Länge) in den entsprechenden Löchern. Führen Sie die Oberseite des Implantats in das Loch des vorgefertigten Schallkopfes ein. Stellen Sie sicher, dass die Innenwand des 3D-gedruckten Rings glatt ist, und platzieren Sie ihn dann um den Schallkopf, der am Schädel der Maus positioniert ist. Stellen Sie sicher, dass der Schallkopf innerhalb des Rings zentriert ist. Tragen Sie Zahnzement auf die Verbindung zwischen dem Ring und dem Schädel auf und warten Sie dann einige Minuten, bis sich der Zahnzement verfestigt hat. Vermeiden Sie es, den Zahnzement auf die Verbindung zwischen dem Schallkopf und dem Schädel zu legen. Entfernen Sie vorsichtig den Geber und ziehen Sie die Schrauben fest an. Bringen Sie die Maus in einen warmen Käfig und stellen Sie sicher, dass sie überwacht wird, bis sie vollständig wiederhergestellt ist, bevor Sie sie wieder in ihren ursprünglichen Käfig zurückbringen. Verabreichen Sie nach der Operation subkutanes Carprofen (2 mg/kg) zur Analgesie und fahren Sie 3 Tage lang alle 24 Stunden fort, um Entzündungen und Schmerzen zu behandeln. Überwachen Sie die Tiere täglich auf Anzeichen von Stress, abnormalem Gewichtsverlust, Schmerzen oder Infektionen. Normalerweise sollten alle Mäuse am 3. Tag nach der Operation ein normales Verhalten zeigen. Wenn bei einer Maus nach dem 3. Tag Anzeichen von Stress oder Krankheit beobachtet werden, befolgen Sie die institutionellen Richtlinien für die Euthanasie. 5. Stimulation und Signalaufzeichnung Schalten Sie 7 Tage nach der Operation die Sauerstoffzufuhr zum Gasanästhesiegerät ein und stellen Sie den Sauerstoffflussregler so ein, dass der Gasfluss auf 300-500 ml/min eingestellt wird. Platzieren Sie die Maus in der Induktionskammer und schließen Sie die Anästhesiegaszufuhr zur Maske. Drehen Sie den Verdampfer-Drehregler, um die entsprechende Anästhesiekonzentration (2% – 2,5%) einzustellen. Nachdem die Maus betäubt wurde, legen Sie sie mit einer Anästhesiemaske auf den stereotaktischen Rahmen. Schließen Sie die Induktionsleitung, um das Narkosegas in die Narkosemaske strömen zu lassen. Passen Sie die entsprechende Erhaltungsanästhesiekonzentration an (1%-1,5%). Reinigen Sie die Oberseite des Implantats mit Alkohol und führen Sie dann das faseroptische Patchkabel in die Mitte des vorbereiteten Schallkopfs ein. Injizieren Sie Wasser in den Raum zwischen dem Implantat und dem 3D-gedruckten Ring mit einer 26G-Nadel und einer 1-ml-Einwegspritze, um den Schädel zu befeuchten. Verwenden Sie Papiertücher, um überschüssiges Wasser aufzusaugen. Injizieren Sie mit einer 26-G-Nadel und einer 1-ml-Einwegspritze ein Haftvermittler in den Raum zwischen dem Implantat und dem 3D-gedruckten Ring, um die einfache Ausbreitung des Ultraschalls vom Schallkopf zum Gehirn zu erleichtern. Verbinden Sie das Implantat mit dem Glasfaser-Patchkabel. Führen Sie den Wandler vorsichtig in den mit einem Haftvermittler gefüllten Bereich ein und ziehen Sie die Schrauben fest an. Platzieren Sie die Maus auf einem freien Feld und lassen Sie sie aufwachen. Befestigen Sie den Wandler an das Ultraschallanregungssystem und verbinden Sie das Glasfaser-Patchkabel mit dem Glasfaseraufzeichnungssystem, um der Maus Bewegungsfreiheit zu ermöglichen.HINWEIS: Das LWL-Patchkabel hat eine Länge von 2m und einen Durchmesser von 1,25 mm. Die Lichtintensität für den Kanal 405 beträgt 20 μW und für den Kanal 470 40 μW. Aktivieren Sie sowohl das Ultraschall-Anregungsgerät als auch das optische Faseraufzeichnungssystem, um die neuronale Ultraschallmodulation mit der optischen Fasersignalaufzeichnung zu synchronisieren.

Representative Results

Die akustische Druckverteilung im freien akustischen Feld auf der XY-Ebene und der XZ-Ebene, die 3,4 mm von der Schallkopfoberfläche entfernt sind, entsprechend der Position des vorderen Thalamuskerns der Maus, ist in Abbildung 2B, C dargestellt. Diese Messungen wurden durch Hydrophon-Scanning im XY-Bereich und XZ-Bereich erfasst. Die Schalldruckverteilung im transkraniellen Schallfeld auf der XY-Ebene und der XZ-Ebene, die 3,4 mm von der Schallkopfoberfläche entfernt sind, ist in Abbildung 2D,E dargestellt. Der gemessene freie Schalldruck beträgt 730 kPa und der gemessene transkranielle Schalldruck 580 kPa für eine Mittenfrequenz von 500 kHz. Die gemessene Dicke des Schädels beträgt durchschnittlich etwa 0,2 mm. Wir gehen davon aus, dass das Ausbreitungsverhältnis annähernd linear ist, so dass der Schädel einen Dämpfungskoeffizienten von 19,98 dB/cmMHz hat. Der leichte, rund 1,66 g schwere Schallkopf ermöglicht eine leichte Bewegung der Maus und erleichtert so die Beobachtung des Ansprechverhaltens der Maus unter FUN und der Bewegungsspur. Die Glasfasersignale wurden unter FUN aufgezeichnet (Abbildung 4B, D), wobei die Hüllkurve quadratisch bzw. sinusförmig ist. In dem Experiment wurden fünf männliche Mäuse verwendet. Das Quadrat dauerte 300 ms, während das kontinuierliche Sinusdiagramm 471 ms dauerte, was sicherstellen kann, dass die Gesamtenergie in zwei verschiedenen FUNs gleich ist (Abbildung 4A,C). Eine Verbesserung des Glasfasersignals deutet auf eine Zunahme der neuronalen Aktivität hin. Die neuronale Reaktion ist unter dem FUN schnell, was darauf hindeutet, dass der Schallkopf über ausreichend Energie und hervorragende Fokussierungsfähigkeiten verfügt. Abbildung 1: Produktionsprozess des Wandlers. Dabei geht es wiederum darum, ein piezoelektrisches Blech mit einem Draht zu verbinden und dann zu verpacken. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Aufbau und Charakterisierung der Ultraschallfeldmessung für Ultraschallwandler. (A) Der Aufbau für die Ultraschallfeldmessung umfasst ein Hydrophon, ein Motorsystem, eine Steuerungssoftware, einen Signalgenerator und ein Oszilloskop. (B, D) Schematische Darstellung von Ultraschallwandlermessungen in freien und transkraniellen akustischen Feldern und die Ergebnisse von transversalen und longitudinalen Schallfeldmessungen. (C, E) Diagramm des transversalen Schallfeldes in der Fokusstellung des Schallwandlers, wobei die rote Linie das Schallfeld in der Position -3 dB anzeigt. (F, G) Wellenformdiagramm des vom Hydrophon gemessenen Ausgangs für den Wandler. Der Bereich innerhalb des rot gestrichelten Kästchens und der Bereich innerhalb des blauen gestrichelten Kästchens stellen die Perioden dar, bevor die Wellenform eine stabile Amplitude erreicht, bzw. die Klingelperiode des Wandlers am Ende. Der Bereich innerhalb des orangefarbenen gestrichelten Kästchens stellt den stabilen Teil der Wellenform dar, der zur Berechnung der Druckamplitude verwendet wird, gekennzeichnet als p. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Berechnungssoftware und Ultraschallparameter. (A) Eine hausgemachte Schnittstelle zur Berechnung von Ultraschallparametern. MI, Isppa und Ispta wurden berechnet. Die Schnittstelle konnte von https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation bezogen werden. (B) Schematische Darstellung von Ultraschalldruckwellenformen. Es werden eine sinusförmige Impulshüllkurve und eine rechteckige Impulshüllkurve verwendet. Die Periode (T) stellt die Dauer eines einzelnen Zyklus der Betriebsfrequenz dar. Ein Puls, der als einzelne kontinuierliche Beschallung bezeichnet wird, dauert eine bestimmte Dauer, die als Pulsdauer (PD) bezeichnet wird. Typischerweise werden Impulse in einer Sequenz wiederholt, die als Impulsfolge bezeichnet wird. Das Zeitintervall zwischen zwei aufeinanderfolgenden Impulsen in einer Impulsfolge wird als Impulswiederholungsintervall (PRI) bezeichnet, berechnet als Kehrwert der Impulswiederholfrequenz (PRF). Die gesamte Abfolge von Impulsen, die als Impulsfolge bezeichnet wird, hat eine bestimmte Dauer, die als Impulsfolgedauer bekannt ist. Die Intervallzeit bezeichnet die Dauer eines einzelnen Versuchs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Signal der Faserphotometrie während FUN. (A, C) Ultraschallparameter, die von Quadrat (B) und sinusförmig (D) umhüllt werden. (B, D) Das Faserphotometriesignal während der FUN von (A) und (C). Der grüne Schatten ist die Dauer von FUN. Die durchgezogene Linie ist der Mittelwert, und die Blau- und Rottöne sind der Mittelwert und die Standardabweichung der aufgezeichneten Signale. In dem Experiment wurden fünf männliche Mäuse verwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Dieser Ansatz kombiniert FUN mit optischer Photometrie und ermöglicht so die Untersuchung der Gehirnfunktion von Mäusen und des in vivo FUN-Mechanismus. Der gesamte operative Prozess, von der Herstellung des Schallkopfs bis hin zu chirurgischen Eingriffen, wird skizziert, so dass die Forscher FUN unabhängig von außerhalb des Feldes durchführen können.

Ein entscheidender Aspekt des Protokolls besteht darin, sicherzustellen, dass das optische Implantat reibungslos in den Schallkopf eingeführt wird, der Zahnzement über dem Schädel dünn genug ist, um mit Ultraschall in das Gehirn einzudringen, das optische Implantat sicher mit dem Schädel verbunden ist, um ein Verschieben während des Experiments zu verhindern, und die Energieabgabe des Schallkopfs für eine effektive Neuromodulation ausreicht. Die Dicke des Zahnzementes, der das Implantat umgibt, sollte gleich oder kleiner als der Durchmesser des Schallkopflochs sein. Daher ist es ratsam, dasselbe Polypropylenrohr sowohl für die Herstellung des Schallkopfs als auch für die Operation zu verwenden. Da Polypropylenrohr nicht an Zahnzement haftet, wird es ausgewählt, um den Zahnzement mit einem Seitenschnitt um das Implantat herum zu formen, um das Entfernen des Polypropylenrohrs zu erleichtern.

Elektrophysiologische Aufzeichnung und optische Photometrieaufzeichnung sind häufig eingesetzte Technologien zur Überwachung der Gehirnaktivität in vivo, die eine hohe zeitlich-räumliche Auflösung bieten. Die elektrophysiologische Aufzeichnung erfasst jedoch das Feueraktivitätssignal von Neuronen, die direkt an den Elektroden befestigt sind. Die Ultraschallwellen könnten die Elektroden direkt in Schwingung versetzen, was zu unnötigen Störeffekten führt. Glücklicherweise erfasst die weniger invasive Faserphotometrie-Technologie die Aktivität der darunter liegenden Neuronen, was die verwirrende Wirkung von Ultraschallvibrationen auf das Implantat verringern könnte 7,19,26. Infolgedessen ermöglicht die Technologie der gleichzeitigen fokussierten Ultraschall-Neuromodulation und der Faserphotometrie-Aufzeichnung bei frei beweglichen Mäusen die Untersuchung von in vivo-Mechanismen der Ultraschall-Neuromodulation und ermöglicht die Beobachtung der Verhaltensreaktionen der Mäuse ohne die Interferenz der Anästhesie.

Die räumliche Auflösung der Faserphotometrie ist jedoch eingeschränkt, da sie nicht in der Lage ist, die Aktivität von subzellulären und Mikroschaltkreisenzu überwachen 24. Darüber hinaus bietet es eine indirekte Darstellung der neuronalen Aktivität, da es die durch die neuronale Aktivität erzeugten elektrischen Signale nicht direkt aufzeichnet.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wird teilweise unterstützt durch die National Natural Science Foundation of China (32371151), das Guangdong High Level Innovation Research Institute (2021B0909050004), den Hong Kong Research Grants Council Collaborative Research Fund (C5053-22GF), den General Research Fund (15224323 und 15104520), den Hong Kong Innovation Technology Fund (MHP/014/19), interne Finanzierung durch die Hong Kong Polytechnic University (G-SACD und 1-CDJM), und die Natural Science Foundation der Provinz Liaoning – Joint Open Fund des State Key Laboratory of Robotics (2022-KF-22-03). Die Autoren danken der Einrichtung und der technischen Unterstützung durch die University Research Facility in Life Sciences (ULS) und die University Research Facility in Behavioral and Systems Neuroscience (UBSN) der Hong Kong Polytechnic University.

Materials

1ml disposable syringe DOUBLE-DOVE 1ml Injection needles
26-gauge needle Jin mao JM-J02 Preparation needles
70% ethanol Dong de alcohol  0.7 Disinfect
alcohol Dong de alcohol  0.75 Clean the transducer surface
Bayonet Nut Connector Risym 75-5 The other end of the connecting wire is connected to the ultrasonic excitation device
copper ring Guowei Metal Materials Outer diameter, wall thickness, height (8mm, 0.2mm, 8mm) The outer protective case of the transducer
disposable syringe DOUBLE-DOVE 1ml The inhalation of epoxy resin allows precise small amounts to be injected into the copper pipe
double-sided tape 3M 3M55236 It is used to fix the transducer and the wire to ensure that the epoxy silver glue does not move before drying
electronic soldering iron Victor 868A+ The soldered wires are connected to the BNC
epoxy resin glue Kraft K 9741 Seal the rear of the transducer
epoxy silver paste Vonroll CB-052 The wire is attached to the positive and negative poles of the piezoelectric ceramic sheet and the resistance is kept low
fader  JOQO YP-7021 Remove the head hair of the mouse
gas anesthesia machine RWD R500 It is used for anesthesia in mice
glass sheet Square glass 80mm*80mm A temporary operating surface for placing piezoelectric ceramics and wires can be used to coat the surface of the glass plate with double-sided tape
ketamine/xylazine  Shutai/shengxin Zoletil 50/2ml*10 Anesthetize the mouse
medical coupling agent Bestman 120g The couplant acts as a medium to conduct the ultrasound signal
mouse Bai shi tong GCaMp6 Test subject
ophthalmic ointment Yun Zhi 0.5% x 2.5 g x1 Moistens the eye area to prevent blindness
 piezoelectric plate Jiaming Electronics Factory Diameter, pore, thickness (7mm, 3mm, 3.56mm) The electrical energy is emitted in the form of ultrasound
polypropylene pipe Baihao Pipe Factory Outer diameter, inner diameter, length (3mm, 2mm, 500mm) Prevent the epoxy resin from plugging the holes and leaving the holes
povidone-iodine lefeke 500ml Disinfect
signal record of fiber Thinker Tech Nanjing Biotech Three-color single-channel fiber optic recording system Record fiber photometry signals
stereotaxic frame RWD 68805 Fix the head of the mouse and localize the brain region
sterile saline Shijiazhuang si yao 500ML,4.5g As a solvent, dissolves the drug
stimulation of ultrasound  Deep Brain Technology DB-USNM Provides stable input to the transducer
weighing machine Qin bo shi 1718 Weigh the mouse
wire Jinpeng Cable Factory 0.3mm2 Voltage is supplied to the transducer
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References

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Li, N., Chen, Z., Zhu, J., Zheng, H., Xia, J., Yuan, Z., Fei, C., Sun, L., Qiu, Z. Simultaneous Focused Ultrasound Neuromodulation and Fiber Photometry Recording in Free-Moving Mouse. J. Vis. Exp. (211), e67090, doi:10.3791/67090 (2024).
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