Neuromodulación simultánea de ultrasonido focalizado y registro de fotometría de fibra en ratón de movimiento libre

Todos los procedimientos y el manejo de los animales cumplieron con las pautas éticas de la NSFC y los requisitos de protocolo aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Inteligencia, Ciencia y Tecnología de Guangdong. 1. Preparación del transductor Prepare una placa piezoeléctrica con un diámetro interior de 3 mm, un diámetro exterior de 7 mm y una frecuencia central de 500 kHz.NOTA: El diámetro exterior se puede ajustar en función de la región específica del cerebro a la que se dirige y debe maximizarse mientras se mantiene la precisión de la estimulación y sin exceder el límite del cráneo del ratón. Conecte el cable a los dos lados de la placa piezoeléctrica con pasta de plata epoxi (Figura 1). Después de que la pasta de plata epoxi se haya solidificado, use un multímetro para medir la resistencia en ambos extremos del cable para asegurarse de que sea aproximadamente 0. Aplique una capa de cinta adhesiva de doble cara sobre una superficie limpia de lámina de vidrio. Se adhiere a la placa piezoeléctrica y al anillo de cobre, con una altura de 8 mm, un diámetro exterior de 8 mm y un diámetro interior de 7,6 mm, firmemente a la lámina de vidrio.NOTA: El diámetro interior del anillo de cobre está determinado por el tamaño de la placa piezoeléctrica para garantizar que la placa esté cubierta por el anillo de cobre. Inserte firmemente el tubo de polipropileno con un diámetro exterior de 3 mm en el centro de la placa piezoeléctrica y adhiéralo firmemente a la lámina de vidrio (Figura 1). Prepare una cantidad adecuada de pegamento de resina epoxi y aspírelo. Extraiga el epoxi con una jeringa desechable e inyéctelo lentamente en el anillo de cobre. Espere unas 10 h hasta que el epoxi se haya solidificado (Figura 1). Suelde los extremos sueltos de dos cables en el conector de la tuerca de bayoneta con un soldador electrónico. Retire la lámina de vidrio. Limpie la superficie del transductor con alcohol (Figura 1). 2. Parámetros de informes para FUN Coloque el hidrófono y el transductor en un tanque de agua lleno de agua desionizada (Figura 2A). Asegúrese de que el haz central (eje Z) del sistema de posicionamiento esté alineado con el eje del transductor. Esta alineación se puede lograr, en primer lugar, descubriendo un campo máximo en el plano focal a través del escaneo 2D; en segundo lugar, identificar un máximo de campo en otro plano con un máximo claro; en tercer lugar, comparar las coordenadas X e Y de los dos máximos y, a continuación, ajustar iterativamente la posición y/o la orientación del transductor si es necesario28. Ajuste la punta del hidrófono con la superficie del transductor a una distancia de 1 mm, manteniendo esta distancia constante mientras coloca el hidrófono en el centro del borde derecho del transductor. Inicie el programa de escaneo para capturar el campo acústico libre en el plano XZ (Figura 2B).NOTA: El método de construcción del hidrófono se puede encontrar en https://github.com/HQArrayLab/Hydrophone_system_control. Mueva el hidrófono a lo largo del eje Z para determinar las profundidades asociadas con la presión máxima espacial. En este experimento, la presión máxima espacial aparece a una distancia de 3,4 mm de la superficie del transductor; mantenga esta distancia cuando mueva el hidrófono a la esquina inferior derecha del transductor en el plano XY. Encienda e inicie el programa de escaneo para capturar el campo acústico libre en el plano XY (Figura 2B). Coloque el transductor en el cráneo de un ratón que se sometió a una cirugía como se describe en el paso 4. Adquiera el campo acústico transcraneal en el plano XZ y el plano XY (Figura 2D) a través del barrido con hidrófono como se describe en 2.1-2.3. Lea las amplitudes de presión en el punto focal, que es la región de pico espacial en el campo acústico libre y el campo acústico transcraneal. La amplitud de presión en el punto focal en el campo acústico libre es de 730k Pa, y en el campo acústico transcraneal es de 580k Pa. Lea las dimensiones focales a -3 dB (Figura 2C,E), y la posición en los planos XY y XZ dentro del campo acústico transcraneal para evaluar si el campo acústico de este transductor puede cubrir las áreas cerebrales objetivo. Calcule el Índice Mecánico (IM), que está limitado por el documento de orientación de la FDA a estar por debajo de 1.9 para mitigar la cavitación. El cálculo de la IM viene dado por la ecuación:(1)donde pr,.3 representa la presión de cresta rarefacción en MPa ajustada por un coeficiente de atenuación de 0,3 dB cm-1 MHz-1, y f0 es la frecuencia de funcionamiento en MHz. La presión rarefaccional máxima del campo transcraneal medida es de 580 kPa, a 3,4 mm del transductor, el f0 es de 500 kHz, por lo que el pr,.3 reducido es de 576,6 kPa. El IM es de 0,82. Calcule la intensidad promedio del pulso de pico espacial (Isppa), que debe estar por debajo de 190 W/cm2 en la dirección del plano de acuerdo con el documento de orientación de la FDA. El cálculo de la intensidad viene dado por la ecuación:(2)donde psp (t) es la presión acústica variable en el tiempo en la ubicación del pico espacial, Z es la impedancia acústica característica del medio (aproximadamente 1.5 x 106 Rayls para tejidos blandos), y la DP es la duración del pulso. En el caso de la envolvente cuadrada, esto se reduce a la ecuación:(3)donde A es la amplitud de la presión de pico espacial. La A medida en la localización focalizada por ultrasonido es de 580 kPa, y la Z del cerebro es de aproximadamente 1,58 x 106 Rayls, por lo que laI sppa de la envoltura cuadrada es de 10,65 W/cm2 y laI sppa de la envoltura sinusoidal es de 10,65 W/cm2. Calcule la intensidad media del tiempo de pico espacial (Ispta), que está limitada por el documento de orientación de la FDA a estar por debajo de 430 mW/cm2 en la dirección del avión. El cálculo de la intensidad viene dado por la ecuación:(4)donde T es el período de tiempo sobre el cual se calcula el promedio. En el caso de la envolvente cuadrada, esto se reduce a la ecuación:(5)donde eltren de pulsos de CC es el ciclo de trabajo del pulso. Aquí, el tren de impulsos de CC es del 1% porque se utilizaron ondas continuas, por lo que I spta es igual a la intensidad media del pulso de pico espacial, 106,5 mW/cm2 para una envolvente cuadrada. El MI, Isppa e Ispta se pueden calcular utilizando el software (Figura 3A). Un código basado en MATLAB para facilitar su uso se puede encontrar en https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation. Informe los parámetros de temporización de pulsos, incluidos Amax, duración del pulso, intervalo de repetición de pulsos, duración del tren de pulsos y envolvente (Figura 3B). 3. Preparación del animal para la cirugía Peso de ratones transgénicos GCaMP6s machos de 8 semanas de edad, con un peso aproximado de unos 20 g. Prepare una solución que contenga ketamina a 10 mg/mL y xilacina a 2 mg/mL en solución salina estéril. Administrar la solución de ketamina/xilacina por inyección intraperitoneal a una dosis de 100 mg/kg de ketamina y 20 mg/kg de xilacina utilizando una aguja de 26 g y una jeringa desechable de 1 mL. Comience la preparación quirúrgica una vez que el animal no responda a los estímulos dolorosos, como el pellizco de los dedos de los pies. Use un fader para recortar el pelo de la cabeza del animal y desinfecte el área con etanol al 70% y povidona yodada antes del procedimiento quirúrgico. Coloque el ratón en posición prona sobre el marco estereotáxico y asegúrese de que el cráneo esté nivelado. Coloque un ungüento oftálmico protector sobre los ojos del animal para mantener la humedad. 4. Procedimiento quirúrgico Haga una incisión a lo largo de la sutura sagital, comenzando desde el hueso occipital hasta el comienzo del hueso nasal. Use tijeras quirúrgicas para quitar la piel que cubre ambos hemisferios. Use solución salina estéril para limpiar el cráneo y eliminar cualquier resto de periostio. Aplique peróxido de hidrógeno al 3% sobre el cráneo expuesto con un hisopo de algodón durante aproximadamente 2 s-3 s para crear microporos. Enjuague bien con solución salina estéril y asegúrese de que el área esté completamente seca. Cree una craneotomía con orificio de fresa de 0,6 mm de diámetro utilizando una broca estéril esterilizada en autoclave sobre la ubicación del área del cerebro según lo determinado por el atlas estereotáxico alineado con bregma y lambda. Lave cualquier residuo con solución salina estéril y asegúrese de un secado completo. Tenga cuidado de no dañar ningún tejido. Inserte la férula de fibra óptica (implante) en el soporte de la sonda y conéctelo al brazo estereotáxico. Alinee el implante directamente sobre la región de interés utilizando el brazo estereotáxico. Al insertar la fibra óptica en el tejido cerebral, avance la fibra lentamente a una velocidad de aproximadamente 2 mm/min. Mezcle el cemento dental para lograr una viscosidad que permita una fácil aplicación en todo el cráneo. Use un palillo de dientes estéril para esparcir una capa delgada de cemento dental sobre el cráneo y sobre la parte inferior del implante. Deja que se seque por completo. Separe el soporte de la sonda con cuidado. Prepare una tubería de polipropileno con una altura de 3 mm, un diámetro exterior de 3 mm y un diámetro interior de 2,6 mm, y luego corte la tubería en toda su longitud. Fije el tubo a la parte inferior del implante con unas pinzas. Vierta el polvo de cemento dental en la tubería, asegurándose de una longitud suficiente por encima del implante para registrar la señal de fibra óptica. Agregue el líquido requerido y espere unos minutos para que el cemento dental se solidifique. Ubique la abertura de la tubería y sujétela con cuidado para quitarla con pinzas. Prepare la mezcla de cemento dental para la aplicación, asegurándose de que se extienda una capa uniforme y delgada por todo el cráneo. Cubra la mayor superficie posible del cráneo con cemento dental. Espere unos minutos para que el cemento dental se solidifique.NOTA: No permita que el cemento dental entre en contacto con la piel del ratón. Perfore tres agujeros (1 mm de diámetro) en el anillo impreso en 3D, divididos uniformemente en el horizonte, con una altura de 7 mm, un diámetro exterior de 10 mm y un diámetro interior de 8,4 mm. Fije los tornillos (de 1 mm de longitud) en sus respectivos orificios. Inserte la parte superior del implante en el orificio del transductor prefabricado. Asegúrate de que la pared interior del anillo impreso en 3D sea lisa y, a continuación, colócalo alrededor del transductor colocado en el cráneo del ratón. Asegúrese de que el transductor esté centrado dentro del anillo. Aplique cemento dental en la unión entre el anillo y el cráneo, luego espere unos minutos para que el cemento dental se solidifique. Evite colocar el cemento dental en la conexión entre el transductor y el cráneo. Retire con cuidado el transductor y apriete firmemente los tornillos. Transfiera el ratón a una jaula caliente y asegúrese de que esté monitoreado hasta que esté completamente recuperado antes de devolverlo a su jaula original. Después de la cirugía, administrar Carprofeno subcutáneo (2 mg/kg) para la analgesia y continuar cada 24 h durante 3 días para controlar la inflamación y el dolor. Monitoree a los animales diariamente para detectar cualquier signo de angustia, pérdida de peso anormal, dolor o infección. Normalmente, altercer día después de la cirugía, todos los ratones deberían exhibir un comportamiento normal. Si se observa algún signo de angustia o enfermedad en un ratón después deltercer día, siga las pautas institucionales para la eutanasia. 5. Estimulación y grabación de señales A los 7 días después de la cirugía, abra el suministro de oxígeno a la máquina de anestesia con gas y ajuste el regulador de flujo de oxígeno para establecer el flujo de gas a 300-500 mL/min. Coloque el ratón en la cámara de inducción y cierre el suministro de gas anestésico a la mascarilla. Gire el dial del vaporizador para ajustar la concentración de anestésico adecuada (2%-2,5%). Después de anestesiar el ratón, colóquelo en el marco estereotáxico con una máscara anestésica. Cierre la línea de inducción para permitir que el gas anestésico fluya hacia la máscara anestésica. Ajustar la concentración adecuada de anestésico de mantenimiento (1%-1,5%). Limpie la superficie superior del implante con alcohol y, a continuación, inserte el cable de conexión de fibra óptica en el centro del transductor preparado. Inyecte agua en el espacio entre el implante y el anillo impreso en 3D con una aguja de 26 G y una jeringa desechable de 1 ml para humedecer el cráneo. Use toallas de papel para absorber el exceso de agua. Inyecte un agente de acoplamiento en el espacio entre el implante y el anillo impreso en 3D utilizando una aguja de 26G y una jeringa desechable de 1 ml para facilitar la fácil propagación del ultrasonido desde el transductor hasta el cerebro. Conecte el implante al cable de conexión de fibra óptica. Inserte con cuidado el transductor en el área que está llena con un agente de acoplamiento y apriete firmemente los tornillos. Coloque el mouse en un campo abierto y permita que se despierte. Conecte el transductor al sistema de excitación ultrasónica y conecte el cable de conexión de fibra óptica al sistema de grabación de fibra óptica, lo que permite la libertad de movimiento del mouse.NOTA: El latiguillo de fibra óptica tiene una longitud de 2 m y un diámetro de 1,25 mm. La intensidad de la luz para el canal 405 es de 20 μW y para el canal 470 es de 40 μW. Active tanto el dispositivo de excitación ultrasónica como el sistema de grabación de fibra óptica para sincronizar la modulación neuronal ultrasónica con la grabación de señales de fibra óptica.