自由移動マウスにおける集束超音波ニューロモデュレーションとファイバー測光の同時記録

すべての手順と動物の取り扱いは、NSFCの倫理ガイドラインに準拠し、広東情報科学技術研究所の施設動物管理および使用委員会の承認されたプロトコル要件に準拠していました。 1. トランスデューサーの準備 内径3mm、外径7mm、中心周波数500kHzの圧電プレートを用意します。注:外径は、標的とされる特定の脳領域に基づいて調整でき、刺激精度を維持しながら、マウスの頭蓋骨の境界を超えないように最大化する必要があります。 エポキシ銀ペーストを使用して、圧電プレートの両側にワイヤーを取り付けます(図1)。エポキシ銀ペーストが固まったら、マルチメータを使用してワイヤの両端の抵抗を測定し、約0であることを確認します。 清潔なガラスシートの表面に両面テープの層を貼り付けます。高さ8mm、外径8mm、内径7.6mmの圧電プレートと銅リングをガラスシートにしっかりと接着します。注意: 銅リングの内径は、圧電プレートのサイズによって決定され、プレートが銅リングで覆われていることを確認します。 圧電プレートの中央に外径3mmのポリプロピレンパイプを確実に挿入し、ガラスシートにしっかりと接着します(図1)。 エポキシ樹脂のりを適量用意し、真空にします。使い捨ての注射器を使用してエポキシを抽出し、ゆっくりと銅リングに注入します。エポキシ樹脂が固まるまで約10時間待ちます(図1)。 電子はんだごてを使用して、2本のワイヤの緩い端をバヨネットナットコネクタにはんだ付けします。ガラスシートを取り外します。トランスデューサーの表面をアルコールで清掃します(図1)。 2. FUNのレポートパラメータ ハイドロフォンとトランスデューサーを脱イオン水で満たされた水タンクに入れます(図2A)。ポジショニングシステムの中央ビーム(Z軸)がトランスデューサーの軸と位置合わせされていることを確認してください。このアライメントは、まず、2Dスキャンを通じて焦点面の最大フィールドを発見することで実現できます。次に、明確な最大値を持つ別の平面のフィールド最大値を特定します。第三に、2つの最大値のX座標とY座標を比較し、必要に応じてトランスデューサの位置および/または向きを繰り返し調整します28。 トランスデューサーの表面を1 mmの距離にしてハイドロフォンの先端を調整し、この距離を一定に保ちながら、ハイドロフォンをトランスデューサーの右端の中央に配置します。スキャンプログラムを開始して、XZ平面の自由音場をキャプチャします(図2B)。注:ハイドロフォンの構築方法は https://github.com/HQArrayLab/Hydrophone_system_control にあります。 ハイドロフォンを Z 軸に沿って移動して、空間ピーク圧力に関連付けられた深さを決定します。この実験では、空間ピーク圧力はトランスデューサーの表面から3.4 mmの距離に現れます。ハイドロフォンをXY平面のトランスデューサーの右下隅に移動するときは、この距離を維持します。電源を入れてスキャンプログラムを開始し、XY平面の自由音場をキャプチャします(図2B)。 手順4で説明したように、手術を受けたマウスの頭蓋骨にトランスデューサーを置きます。2.1-2.3で説明されているように、ハイドロフォンスキャンを通じてXZ平面とXY平面(図2D)の経頭蓋音場を取得します。 自由音場と経頭蓋音場の空間ピーク領域である焦点での圧力振幅を読み取ります。自由音場の焦点での圧力振幅は730k Paで、経頭蓋音場では580k Paです。-3 dBでの焦点寸法(図2C、E)と、経頭蓋音場内のXY面とXZ面の位置を読み取り、このトランスデューサの音場が標的の脳領域をカバーできるかどうかを評価します。 キャビテーションを軽減するために、FDA のガイダンス ドキュメントによって 1.9 未満に制限されている機械指数 (MI) を計算します。MIの計算は、次の式で与えられます。(1)ここで、p r,.3 は 0.3 dB cm-1 MHz-1 の減衰係数で調整されたピーク希薄圧力 (MPa) を表し、 f0 は動作周波数 (MHz) です。測定された経頭蓋場ピーク希薄圧は、トランスデューサーから3.4 mmのところで580 kPa、 f0 は500 kHz、したがって、ディレーティングされたpr,.3 は576.6 kPaです。MIは0.82です。 FDAのガイダンス文書に従って、平面方向に190 W / cm2未満である必要がある空間ピークパルス平均強度(Isppa)を計算します。強度の計算は、次の式で与えられます。(2)ここで、psp (t) は空間ピーク位置での時間変動する音圧、 Z は媒体の特性音響インピーダンス (約 1.5 x 106 Rayls for soft tissue)、PDはパルス持続時間です。正方形のエンベロープの場合、これは次の式に帰着します。(3)ここで、Aは空間ピーク圧力振幅です。超音波集束位置で測定されたAは580 kPaで、脳のZは約1.58 x 106 Raylsであるため、正方形のエンベロープのIスッパ は10.65 W / cm2 であり、正弦波エンベロープのIスッパ は10.65 W / cm2です。 空間ピーク時間平均強度 (Ispta) を計算します。これは、FDA のガイダンス ドキュメントによって平面方向の 430 mW/cm2 未満に制限されています。強度の計算は、次の式で与えられます。(4)ここで、T は平均が計算される期間です。正方形のエンベロープの場合、これは次の式に帰着します。(5)ここで、DCパルス列 はパルスのデューティサイクルです。ここで、連続波が使用されたため、DCパルス列は1%であり、 Isptaは空間ピークパルス平均強度に等しく、正方形のエンベロープの場合は106.5 mW / cm2 です。MI、 Isppa、 Ispta は、ソフトウェアを使用して計算できます(図3A)。使いやすいMATLABベースのコードは、https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation にあります。 A最大、パルス持続時間、パルス繰り返し間隔、パルス列持続時間、エンベロープなどのパルスタイミングパラメータを報告します(図3B)。 3.手術のための動物の準備 体重は8週齢の雄GCaMP6sトランスジェニックマウスで、体重は約20gです。滅菌生理食塩水にケタミンを10 mg / mLで、キシラジンを2 mg / mLで含有する溶液を調製します。.26Gの針と1mLの使い捨て注射器を使用して、100 mg / kgのケタミンと20 mg / kgのキシラジンの投与量で腹腔内注射によりケタミン/キシラジン溶液を投与します。.動物がつま先のつま先をつまむような痛みを伴う刺激に反応しなくなったら、外科的準備を開始します。 フェーダーを使用して動物の頭の毛を切り取り、外科的処置の前に70%エタノールとポビドンヨードでその部分を消毒します。 マウスを脳定位固定装置フレームの腹臥位に置き、頭蓋骨が水平であることを確認します。動物の目の上に保護用の眼軟膏を塗り、水分を保ちます。 4. 外科的処置 後頭骨から鼻骨の始まりまで、矢状縫合糸に沿って切開を行います。外科用ハサミを使用して、両方の半球を覆っている皮膚を取り除きます。 滅菌生理食塩水を使用して頭蓋骨を洗浄し、残っている骨膜を取り除きます。 露出した頭蓋骨に綿棒を使用して約2秒〜3秒間3%過酸化水素を塗布し、微細孔を作成します。滅菌生理食塩水で十分にすすぎ、その領域が完全に乾いていることを確認します。 ブレグマとラムダに整列した脳定位アトラスによって決定される脳領域の位置の上にある滅菌済みのオートクレーブドリルビットを使用して、直径0.6mmのバリ穴開頭術を作成します。滅菌生理食塩水で破片を洗い流し、完全に乾燥させます。ティッシュを傷つけないように注意してください。 光ファイバーフェルール(インプラント)をプローブホルダーに挿入し、脳定位固定アームに接続します。 脳定位固定アームを使用して、インプラントを関心領域の真上に位置合わせします。光ファイバーを脳組織に挿入する際は、約2mm/minの速度でゆっくりと進めてください。 歯科用セメントを混合して、頭蓋骨全体に簡単に塗布できる粘度を実現します。滅菌爪楊枝を使用して、歯科用セメントの薄い層を頭蓋骨の上とインプラントの下部に広げます。完全に乾かします。 プローブホルダーを慎重に取り外します。高さ3mm、外径3mm、内径2.6mmのポリプロピレンパイプを用意し、パイプを全長にわたって切断します。 ピンセットを使用してパイプをインプラントの底に取り付けます。歯科用セメント粉末をパイプに注ぎ、光ファイバー信号を記録するためにインプラントの上に十分な長さを確保します。必要な液体を追加し、歯科用セメントが固まるまで数分待ちます。 パイプの開口部を特定し、慎重にcl ピンセットを使用してパイプを取り外すためにそれを囲みます。歯科用セメント混合物を塗布する準備をし、頭蓋骨全体に均一で薄い層が広がるようにします。頭蓋骨の表面積をできるだけ歯科用セメントで覆います。デンタルセメントが固まるまで数分待ちます。注意: 歯科用セメントをマウスの皮膚に接触させないでください。 3Dプリントされたリングに3つの穴(直径1mm)をドリルで開け、水平線上に均等に分割し、高さ7 mm、外径10 mm、内径8.4 mmにします。ネジ(長さ1 mm)をそれぞれの穴に固定します。 インプラントの上部を、事前に製造されたトランスデューサーの穴に挿入します。3Dプリントリングの内壁が滑らかであることを確認してから、マウスの頭蓋骨に配置されたトランスデューサーの周りに配置します。トランスデューサーがリングの中央にあることを確認します。 リングと頭蓋骨の間の接合部に歯科用セメントを塗布し、歯科用セメントが固まるまで数分待ちます。トランスデューサーと頭蓋骨の間の接続部に歯科用セメントを置かないでください。 トランスデューサーを慎重に取り外し、ネジをしっかりと締めます。マウスを温かいケージに移し、完全に回復するまで監視してから元のケージに戻します。 手術後、鎮痛のために皮下カルプロフェン(2 mg / kg)を投与し、炎症と痛みを管理するために24時間ごとに3日間続けます。.苦痛、異常な体重減少、痛み、または感染の兆候がないか、動物を毎日監視してください。通常、術後3日目までに 、すべてのマウスは正常な行動を示すはずです。3日目 以降にマウスに苦痛や病気の兆候が観察された場合は、安楽死に関する施設のガイドラインに従ってください。 5.刺激と信号の記録 手術後7日で、ガス麻酔器への酸素供給をオンにし、酸素流量調整器を調整してガス流量を300〜500mL / minに設定します。 マウスを誘導チャンバーに入れ、マスクへの麻酔ガスの供給を閉じます。気化器のダイヤルを回して、適切な麻酔薬濃度(2%〜2.5%)を調整します。 マウスに麻酔をかけた後、麻酔マスクを装着してマウスを定位固定装置フレームに置きます。誘導ラインを閉じて、麻酔ガスを麻酔マスクに流します。適切な維持麻酔薬濃度(1%-1.5%)を調整します。 インプラントの上面をアルコールで洗浄し、準備したトランスデューサーの中央に光ファイバーパッチコードを挿入します。 26Gの針と1mLの使い捨て注射器を使用して、インプラントと3Dプリントリングの間のスペースに水を注入し、頭蓋骨を湿らせます。ペーパータオルを使用して余分な水分を吸収します。 26Gの針と1mLの使い捨てシリンジを使用して、インプラントと3Dプリントリングの間のスペースにカップリング剤を注入し、トランスデューサーから脳への超音波の伝播を容易にします。 インプラントを光ファイバーパッチコードに接続します。カップリング剤が充填された領域にトランスデューサーを慎重に挿入し、ネジをしっかりと締めます。 マウスをオープンフィールドに置き、ウェイクアップさせます。超音波励起システムにトランスデューサを取り付け、光ファイバーパッチコードを光ファイバー記録システムに接続すると、マウスの動きが自由になります。注:光ファイバーパッチコードの長さは2m、直径は1.25mmです。光強度は、405チャンネルが20μW、470チャンネルが40μWです。 超音波励起装置と光ファイバー記録システムの両方を作動させて、超音波神経変調と光ファイバー信号記録を同期させます。