التعديل العصبي بالموجات فوق الصوتية المركزة في وقت واحد وتسجيل القياس الضوئي للألياف في الماوس الحر الحركة
Summary
يتضمن البروتوكول تصنيع محول الطاقة ، والإبلاغ عن المعلمات ، والإجراءات الجراحية ، وتسجيل الإشارات لسير العمل التشغيلي الكامل للتعديل العصبي بالموجات فوق الصوتية المركزة المتزامنة وتسجيل القياس الضوئي للألياف في الفئران حرة الحركة.
Abstract
يمثل التعديل العصبي بالموجات فوق الصوتية المركزة (FUN) نهجا واعدا للاضطراب غير الجراحي للدوائر العصبية في مناطق الدماغ العميقة. وهو متوافق مع معظم الطرائق الحالية لمراقبة وظائف الدماغ في الجسم الحي. لا يمكننا التكامل مع طرق تسجيل وظائف الدماغ من معالجة أوامر واضطرابات وظائف الدماغ المحددة من خلال ردود الفعل ذات الحلقة المغلقة فحسب ، بل يوفر لنا أيضا رؤى ميكانيكية حول FUN نفسها. هنا ، نقدم بروتوكولا معدلا وبسيطا ويمكن الاعتماد عليه وقويا للتطبيق المتزامن لتسجيل مضان FUN وقياس الألياف الضوئية GCaMP6s في الفئران حرة الحركة. يتضمن ذلك تصنيع محول طاقة واحد جيد الحجم ووضعه مؤقتا على الفئران ، إلى جانب التثبيت الآمن لزرع الألياف الضوئية لتسهيل المرور السلس للمحول. يوفر الجمع بين FUN والقياس الضوئي للألياف التسجيل البصري لاستجابات الدوائر العصبية عند FUN في الوقت الفعلي في مناطق الدماغ العميقة. لإثبات كفاءة هذا البروتوكول ، تم استخدام الفئران Thy1-GCaMP6s كمثال لتسجيل النشاط العصبي في النواة المهادية الأمامية أثناء FUN أثناء تحرك الفئران بحرية. نعتقد أن هذا البروتوكول يمكن أن يعزز الاستخدام الواسع النطاق ل FUN في كل من مجال علم الأعصاب ومجال الموجات فوق الصوتية الطبية الحيوية.
Introduction
برز التعديل العصبي بالموجات فوق الصوتية المركزة (FUN) كأداة تعديل عصبي واعدة ومتعددة الاستخدامات ، مما يتيح استكشاف وظائف الدماغ وتنظيمه بإمكانات كبيرة1. FUN قادر على توصيل الطاقة الصوتية بشكل غير جراحي إلى أي موضع داخل أنسجة المخ بدقةمتناهية 2. إن قدرته على تعديل النشاط العصبي بشكل عابر وعكسي في بنية الدماغ العميقة ، مع خصوصية زمانية مكانية عالية ، بطريقة آمنة وغير جراحية ، تمثل سمة جذابة تكمل تقنية التعديل العصبي السريرية الحالية3. تم تأكيد إظهار FUN الفعال في كل من الأشخاص4،5،6 وفي نماذج حيوانية مختلفة ، تشملالأنواع الصغيرة 7،8،9،10 والأنواع الكبيرة11،12،13،14،15،16،17.
من خلال مراقبة تأثير FUN على أنواع عصبية محددة من خلال مراقبة النشاط العصبي أثناء FUN ، يمكننا الخوض في الآلية الكامنة وراء هذه العملية18,19. أصبح القياس الضوئي للألياف القائم على مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) مستخدما على نطاق واسع في العقد الماضي كطريقة متعددة الاستخدامات لتتبع النشاط السكاني الخاص بنوع الخلية في الجسم الحي20،21،22،23،24. وبالتالي ، فإن التطبيق المتزامن ل FUN والقياس الضوئي للألياف يمكن أن يثري بشكل كبير فهمنا الشامل ل FUN. ومع ذلك ، فإن استخدام محولات الطاقة المفردة الضخمة يستلزم التثبيت بإطار ، بينما تحتاج إلى الخضوع للتخدير وتجميدها في إطار مجسم7،19،25،26. قد لا يكون هذا النهج مناسبا لأنواع معينة من التجارب المتعلقة بالإدراك والإدراك وتقييم السلوك. من الأهمية بمكان إنشاء بروتوكول يسهل دمج FUN والقياس الضوئي للألياف دون إعاقة تعبئة الفئران7.
في هذه الدراسة ، نقدم بروتوكولا منقحا مستخدما في دراساتنا السابقة لاستكمال طريقة صياغة محول طاقة واحد بسلاسة ورشاقة وتثبيته المؤقت على الفئران ، بالإضافة إلى التثبيت الآمن لزرع الألياف الضوئية لتسهيل المرور السلس لمحول الطاقة7،19،26. يسمح للباحثين بتسجيل النشاط العصبي المعدل بواسطة الموجات فوق الصوتية في الفئران غير المقيدة. اخترنا مظروفا أكثر سلاسة ، مثل المغلف الجيبي ، لتقليل الارتباك السمعي27. يتم تأكيد جدوى هذا البروتوكول من خلال التسجيل المتزامن للنشاط العصبي في النواة المهادية الأمامية للفئران حرة الحركة أثناء FUN. يوضح أن طاقة محول الطاقة كافية لتحقيق التعديل العصبي ، ويمكن أن تضمن طرق التثبيت لزرع الألياف الضوئية ومحول الطاقة استقرارها.
Protocol
Representative Results
Discussion
يجمع هذا النهج بين FUN وتسجيل القياس الضوئي البصري ، مما يتيح التحقيق في وظائف دماغ الماوس وآلية FUN في الجسم الحي . تم تحديد العملية التشغيلية الكاملة ، من تصنيع محول الطاقة إلى العمليات الجراحية ، مما يسمح للباحثين بإجراء FUN بشكل مستقل من خارج المجال.
أحد الجوانب الحاسمة للبروتوكول هو التأكد من إدخال الغرسة البصرية بسلاسة في محول الطاقة ، والأسمنت السني عبر الجمجمة رقيق بما يكفي لاختراق الموجات فوق الصوتية في الدماغ ، ويتم توصيل الغرسة البصرية بشكل آمن بالجمجمة لمنع إزاحة أثناء التجربة ، وإنتاج الطاقة من محول الطاقة يكفي للتعديل العصبي الفعال. يجب أن يكون سمك الأسمنت السني المحيط بالزرع مساويا أو أقل من قطر فتحة محول الطاقة. لذلك ، ينصح باستخدام نفس أنبوب البولي بروبلين لكل من عملية تصنيع محول الطاقة والجراحة. نظرا لأن أنبوب البولي بروبلين لا يلتصق بأسمنت الأسنان ، فقد تم اختياره لتشكيل الأسمنت السني حول الغرسة ، بقطع جانبي ، لتسهيل إزالة أنبوب البولي بروبلين بسهولة.
التسجيل الفيزيولوجي الكهربي وتسجيل القياس الضوئي البصري هما تقنيتان شائعتان لمراقبة نشاط الدماغ في الجسم الحي ، مما يوفر دقة زمنية مكانية عالية. ومع ذلك ، فإن التسجيل الفيزيولوجي الكهربية يلتقط إشارة نشاط الإطلاق من الخلايا العصبية المتصلة بالأقطاب الكهربائية مباشرة. يمكن للموجات فوق الصوتية أن تهتز الأقطاب الكهربائية مباشرة ، مما يؤدي إلى تأثيرات مربكة غير ضرورية. لحسن الحظ ، فإن تقنية القياس الضوئي للألياف ، وهي أقل توغلا ، تلتقط نشاط الخلايا العصبية تحتها ، مما قد يقلل من التأثير المربك لاهتزاز الموجات فوق الصوتية على الغرسة7،19،26. ونتيجة لذلك ، فإن تقنية التعديل العصبي بالموجات فوق الصوتية المركزة في وقت واحد وتسجيل القياس الضوئي للألياف في الفئران حرة الحركة تسمح بدراسة آليات التعديل العصبي بالموجات فوق الصوتية في الجسم الحي وتمكن من مراقبة الاستجابات السلوكية للفئران دون تدخل التخدير.
ومع ذلك ، فإن الدقة المكانية للقياس الضوئي للألياف مقيدة لأنها غير قادرة على مراقبة نشاط الدوائر تحت الخلوية والدوائر الدقيقة24. علاوة على ذلك ، فإنه يوفر تمثيلا غير مباشر للنشاط العصبي لأنه لا يسجل مباشرة الإشارات الكهربائية الناتجة عن النشاط العصبي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32371151) ، ومعهد قوانغدونغ لبحوث الابتكار عالي المستوى (2021B0909050004) ، وصندوق البحوث التعاونية لمجلس هونغ كونغ للمنح البحثية (C5053-22GF) ، وصندوق البحوث العامة (15224323 و 15104520) ، وصندوق هونغ كونغ لتكنولوجيا الابتكار (MHP / 014/19) ، والتمويل الداخلي من جامعة هونغ كونغ للفنون التطبيقية (G-SACD و 1-CDJM) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة لياونينغ – الصندوق المفتوح المشترك لمختبر الدولة الرئيسي للروبوتات (2022-KF-22-03). يود المؤلفون أن يشكروا المرفق والدعم الفني من مرفق الأبحاث الجامعية في علوم الحياة (ULS) ومرفق الأبحاث الجامعية في علم الأعصاب السلوكي والأنظمة (UBSN) بجامعة هونغ كونغ للفنون التطبيقية.
Materials
| 1ml disposable syringe | DOUBLE-DOVE | 1ml | Injection needles |
| 26-gauge needle | Jin mao | JM-J02 | Preparation needles |
| 70% ethanol | Dong de alcohol | 0.7 | Disinfect |
| alcohol | Dong de alcohol | 0.75 | Clean the transducer surface |
| Bayonet Nut Connector | Risym | 75-5 | The other end of the connecting wire is connected to the ultrasonic excitation device |
| copper ring | Guowei Metal Materials | Outer diameter, wall thickness, height (8mm, 0.2mm, 8mm) | The outer protective case of the transducer |
| disposable syringe | DOUBLE-DOVE | 1ml | The inhalation of epoxy resin allows precise small amounts to be injected into the copper pipe |
| double-sided tape | 3M | 3M55236 | It is used to fix the transducer and the wire to ensure that the epoxy silver glue does not move before drying |
| electronic soldering iron | Victor | 868A+ | The soldered wires are connected to the BNC |
| epoxy resin glue | Kraft | K 9741 | Seal the rear of the transducer |
| epoxy silver paste | Vonroll | CB-052 | The wire is attached to the positive and negative poles of the piezoelectric ceramic sheet and the resistance is kept low |
| fader | JOQO | YP-7021 | Remove the head hair of the mouse |
| gas anesthesia machine | RWD | R500 | It is used for anesthesia in mice |
| glass sheet | Square glass | 80mm*80mm | A temporary operating surface for placing piezoelectric ceramics and wires can be used to coat the surface of the glass plate with double-sided tape |
| ketamine/xylazine | Shutai/shengxin | Zoletil 50/2ml*10 | Anesthetize the mouse |
| medical coupling agent | Bestman | 120g | The couplant acts as a medium to conduct the ultrasound signal |
| mouse | Bai shi tong | GCaMp6 | Test subject |
| ophthalmic ointment | Yun Zhi | 0.5% x 2.5 g x1 | Moistens the eye area to prevent blindness |
| piezoelectric plate | Jiaming Electronics Factory | Diameter, pore, thickness (7mm, 3mm, 3.56mm) | The electrical energy is emitted in the form of ultrasound |
| polypropylene pipe | Baihao Pipe Factory | Outer diameter, inner diameter, length (3mm, 2mm, 500mm) | Prevent the epoxy resin from plugging the holes and leaving the holes |
| povidone-iodine | lefeke | 500ml | Disinfect |
| signal record of fiber | Thinker Tech Nanjing Biotech | Three-color single-channel fiber optic recording system | Record fiber photometry signals |
| stereotaxic frame | RWD | 68805 | Fix the head of the mouse and localize the brain region |
| sterile saline | Shijiazhuang si yao | 500ML,4.5g | As a solvent, dissolves the drug |
| stimulation of ultrasound | Deep Brain Technology | DB-USNM | Provides stable input to the transducer |
| weighing machine | Qin bo shi | 1718 | Weigh the mouse |
| wire | Jinpeng Cable Factory | 0.3mm2 | Voltage is supplied to the transducer |
References
- Wang, J. B., et al. Focused ultrasound for noninvasive, focal pharmacologic neurointervention. Front Neurosci. 14, 514541 (2020).
- Bystritsky, A., et al. A review of low-intensity focused ultrasound pulsation. Brain stimulation. 4 (3), 125-136 (2011).
- Di Ianni, T., et al. High-throughput ultrasound neuromodulation in awake and freely behaving rats. Brain stimulation. 16 (6), 1743-1752 (2023).
- Legon, W., et al. Transcranial focused ultrasound modulates the activity of primary somatosensory cortex in humans. Nat Neurosci. 17 (2), 322-329 (2014).
- Badran, B. W., et al. Sonication of the anterior thalamus with mri-guided transcranial focused ultrasound (tfus) alters pain thresholds in healthy adults: A double-blind, sham-controlled study. Brain stimulation. 13 (6), 1805-1812 (2020).
- Yaakub, S. N., et al. Transcranial focused ultrasound-mediated neurochemical and functional connectivity changes in deep cortical regions in humans. Nat Comm. 14 (1), 5318 (2023).
- Murphy, K. R., et al. A tool for monitoring cell type-specific focused ultrasound neuromodulation and control of chronic epilepsy. Proc Natl Acad Sci. 119 (46), e2206828119 (2022).
- Niu, X., Yu, K., He, B. Transcranial focused ultrasound induces sustained synaptic plasticity in rat hippocampus. Brain Stimulation. 15 (2), 352-359 (2022).
- Tufail, Y., et al. Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits. Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).
- Yang, Y., et al. Induction of a torpor-like hypothermic and hypometabolic state in rodents by ultrasound. Nat Metabol. 5 (5), 789-803 (2023).
- Kubanek, J., et al. Remote, brain region-specific control of choice behavior with ultrasonic waves. Sci Adv. 6 (21), eaaz4193 (2020).
- Deffieux, T., et al. Low-intensity focused ultrasound modulates monkey visuomotor behavior. Curr Biol. 23 (23), 2430-2433 (2013).
- Gaur, P., et al. Histologic safety of transcranial focused ultrasound neuromodulation and magnetic resonance acoustic radiation force imaging in rhesus macaques and sheep. Brain stimulation. 13 (3), 804-814 (2020).
- Fouragnan, E. F., et al. The macaque anterior cingulate cortex translates counterfactual choice value into actual behavioral change. Nat Neurosci. 22 (5), 797-808 (2019).
- Folloni, D. Ultrasound neuromodulation of the deep brain. Science. 377 (6606), 589-589 (2022).
- Verhagen, L., et al. Offline impact of transcranial focused ultrasound on cortical activation in primates. Elife. 8, e40541 (2019).
- Yang, P. -. F., et al. Neuromodulation of sensory networks in monkey brain by focused ultrasound with mri guidance and detection. Sci Rep. 8 (1), 7993 (2018).
- Yu, K., Niu, X., Krook-Magnuson, E., He, B. Intrinsic functional neuron-type selectivity of transcranial focused ultrasound neuromodulation. Nat Comm. 12 (1), 2519 (2021).
- Zhu, J., et al. The mechanosensitive ion channel piezo1 contributes to ultrasound neuromodulation. Proc Natl Acad Sci. 120 (18), e2300291120 (2023).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Shen, W., et al. M4 muscarinic receptor signaling ameliorates striatal plasticity deficits in models of l-dopa-induced dyskinesia. Neuron. 88 (4), 762-773 (2015).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nat Meth. 16 (7), 649-657 (2019).
- Inoue, M., et al. Rational engineering of xcamps, a multicolor geci suite for in vivo imaging of complex brain circuit dynamics. Cell. 177 (5), 1346-1360.e24 (2019).
- Legaria, A. A., et al. Fiber photometry in striatum reflects primarily nonsomatic changes in calcium. Nat Neurosci. 25 (9), 1124-1128 (2022).
- Kamimura, H. A., et al. Focused ultrasound neuromodulation of cortical and subcortical brain structures using 1.9 mhz. Med Phys. 43 (10), 5730-5735 (2016).
- Xian, Q., et al. Modulation of deep neural circuits with sonogenetics. Proc Natl Acad Sci. 120 (22), e2220575120 (2023).
- Mohammadjavadi, M., et al. Elimination of peripheral auditory pathway activation does not affect motor responses from ultrasound neuromodulation. Brain stimulation. 12 (4), 901-910 (2019).
- Harris, G. R., et al. Hydrophone measurements for biomedical ultrasound applications: A review. IEEE Trans Ultrasonics Ferroelect Freq Cont. 70 (2), 85-100 (2022).
Tags
.