Gelijktijdige gefocusseerde ultrasone neuromodulatie en opname van vezelfotometrie in vrij bewegende muizen

Alle procedures en behandeling van dieren voldeden aan de ethische richtlijnen van de NSFC en de goedgekeurde protocolvereisten van het Institutional Animal Care and Use Committee van het Guangdong Institute of Intelligence Science and Technology. 1. Voorbereiding van de transducer Bereid een piëzo-elektrische plaat voor met een binnendiameter van 3 mm, een buitendiameter van 7 mm en een middenfrequentie van 500 kHz.OPMERKING: De buitendiameter kan worden aangepast op basis van het specifieke hersengebied waarop het doelwit is en moet worden gemaximaliseerd met behoud van stimulatienauwkeurigheid en zonder de grens van de muizenschedel te overschrijden. Bevestig de draad aan de twee zijden van de piëzo-elektrische plaat met behulp van epoxyzilverpasta (Figuur 1). Nadat de epoxyzilverpasta is gestold, gebruikt u een multimeter om de weerstand aan beide uiteinden van de draad te meten om er zeker van te zijn dat deze ongeveer 0 is. Breng een laag dubbelzijdige tape aan op een schoon oppervlak van een glasplaat. Plak de piëzo-elektrische plaat en koperen ring, met een hoogte van 8 mm, een buitendiameter van 8 mm en een binnendiameter van 7,6 mm, stevig vast aan de glasplaat.NOTITIE: De binnendiameter van de koperen ring wordt bepaald door de grootte van de piëzo-elektrische plaat om ervoor te zorgen dat de plaat wordt bedekt door de koperen ring. Steek de polypropyleen buis met een buitendiameter van 3 mm stevig in het midden van de piëzo-elektrische plaat en bevestig deze stevig aan de glasplaat (Figuur 1). Bereid een geschikte hoeveelheid epoxyharslijm voor en stofzuig deze. Extraheer de epoxy met behulp van een wegwerpspuit en injecteer deze langzaam in de koperen ring. Wacht ongeveer 10 uur tot de epoxy is gestold (Figuur 1). Soldeer de losse uiteinden van twee draden met een elektronische soldeerbout op de bajonetmoerconnector. Verwijder de glasplaat. Reinig het oppervlak van de transducer met alcohol (Figuur 1). 2. Rapportageparameters voor FUN Plaats de hydrofoon en transducer in een watertank gevuld met gedeïoniseerd water (Figuur 2A). Zorg ervoor dat de centrale balk (Z-as) van het positioneringssysteem is uitgelijnd met de as van de transducer. Deze uitlijning kan worden bereikt door ten eerste een maximaal veld in het brandpuntsvlak te ontdekken door middel van 2D-scannen; ten tweede, het identificeren van een veldmaximum in een ander vlak met een duidelijk maximum; ten derde, het vergelijken van de X- en Y-coördinaten van de twee maxima en vervolgens iteratief de positie en/of oriëntatie van de transducer aanpassen indien nodig28. Stel de punt van de hydrofoon af met het oppervlak van de transducer op een afstand van 1 mm en houd deze afstand constant terwijl u de hydrofoon in het midden van de rechterrand van de transducer plaatst. Start het scanprogramma om het vrije akoestische veld in het XZ-vlak vast te leggen (Figuur 2B).OPMERKING: De constructiemethode van de hydrofoon is te vinden op https://github.com/HQArrayLab/Hydrophone_system_control. Beweeg de hydrofoon langs de Z-as om de diepten te bepalen die horen bij de ruimtelijke piekdruk. In dit experiment verschijnt de ruimtelijke piekdruk op een afstand van 3,4 mm van het oppervlak van de transducer; houd deze afstand aan wanneer u de hydrofoon naar de rechterbenedenhoek van de transducer op het XY-vlak verplaatst. Schakel het scanprogramma in en start het om het vrije akoestische veld in het XY-vlak vast te leggen (Figuur 2B). Plaats de transducer op de schedel van een muis die een operatie heeft ondergaan zoals beschreven in stap 4. Verkrijg het transcraniële akoestische veld op het XZ-vlak en het XY-vlak (Figuur 2D) door middel van hydrofoonscanning zoals beschreven in 2.1-2.3. Lees de drukamplitudes af in het brandpunt, het ruimtelijke piekgebied in het vrije akoestische veld en het transcraniële akoestische veld. De drukamplitude in het brandpunt in het vrije akoestische veld is 730 k Pa en in het transcraniële akoestische veld is 580 k Pa. Lees de brandpuntsafstanden bij -3 dB (Figuur 2C, E) en de positie op de XY- en XZ-vlakken binnen het transcraniële akoestische veld om te beoordelen of het akoestische veld van deze transducer de doelhersengebieden kan bestrijken. Bereken de mechanische index (MI), die door de FDA-richtlijnen wordt beperkt tot minder dan 1,9 om cavitatie te verminderen. De berekening van MI wordt gegeven door de vergelijking:(1)waarbij pr,.3 de piek-zeldzame druk in MPa vertegenwoordigt, gecorrigeerd met een verzwakkingscoëfficiënt van 0.3 dB cm-1 MHz-1, en f0 de werkfrequentie in MHz is. De gemeten piekdruk in de zeldzame fredelijkheid van het transcraniële veld is 580 kPa, 3,4 mm van de transducer, de f0 is 500 kHz, dus de verlaagde pr,.3 is 576,6 kPa. De MI is 0,82. Bereken de gemiddelde intensiteit van de ruimtelijke-piekpuls (Isppa), die volgens de FDA-richtlijnen lager moet zijn dan 190 W/cm2 in de vlakke richting. De berekening van de intensiteit wordt gegeven door de vergelijking:(2)waarbij psp (t) de in de tijd variërende akoestische druk op de ruimtelijke pieklocatie is, is Z de karakteristieke akoestische impedantie van het medium (ongeveer 1.5 x 106 Rayls voor zacht weefsel), en PD is de pulsduur. In het geval van de vierkante envelop komt dit neer op de vergelijking:(3)waarbij A de amplitude van de ruimtelijke-piekdruk is. De A gemeten op de ultrasone gefocusseerde locatie is 580 kPa en de Z van de hersenen is ongeveer 1,58 x 106 Rayls, dus de Isppa van de vierkante envelop is 10,65 W/cm2 en de Isppa van de sinusvormige envelop is 10,65 W/cm2. Bereken de gemiddelde intensiteit van de ruimtelijke-piektijd (Ispta), die door de FDA-richtlijnen wordt beperkt tot minder dan 430 mW/cm2 in de vlakke richting. De berekening van de intensiteit wordt gegeven door de vergelijking:(4)waarbij T de tijdsperiode is waarover het gemiddelde wordt berekend. In het geval van de vierkante envelop komt dit neer op de vergelijking:(5)waarbij deDC-pulstrein de inschakelduur van de puls is. Hier is de DC-pulstrein 1% omdat er continue golven zijn gebruikt, dus de Ispta is gelijk aan de ruimtelijke-piekpuls-gemiddelde intensiteit, 106,5 mW/cm2 voor een vierkante envelop. De MI, Isppa en Ispta kunnen worden berekend met behulp van de software (Figuur 3A). Een op MATLAB gebaseerde code voor eenvoudig gebruik is te vinden op https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation. Rapporteer de pulstimingparameters, waaronder Amax, pulsduur, pulsherhalingsinterval, pulstreinduur en envelop (Afbeelding 3B). 3. Het dier voorbereiden op de operatie Weeg 8 weken oude mannelijke GCaMP6s transgene muizen, met een gewicht van ongeveer 20 g. Bereid een oplossing met ketamine van 10 mg/ml en xylazine van 2 mg/ml in steriele zoutoplossing. Dien de ketamine/xylazine-oplossing toe via intraperitoneale injectie in een dosering van 100 mg/kg ketamine en 20 mg/kg xylazine met behulp van een naald van 26 g en een wegwerpspuit van 1 ml. Begin met chirurgische voorbereiding zodra het dier niet meer reageert op pijnlijke prikkels, zoals het knijpen van de teen. Gebruik een fader om het haar op de kop van het dier te trimmen en desinfecteer het gebied met 70% ethanol en povidonjodium voorafgaand aan de chirurgische ingreep. Plaats de muis in buikligging op het stereotaxische frame en zorg ervoor dat de schedel waterpas is. Breng een beschermende oogzalf aan op de ogen van het dier om vocht vast te houden. 4. Chirurgische ingreep Maak een incisie langs de sagittale hechting, beginnend bij het achterhoofdsbeen tot het begin van het neusbeen. Gebruik een chirurgische schaar om de huid die beide hemisferen bedekt te verwijderen. Gebruik steriele zoutoplossing om de schedel te reinigen en eventueel achtergebleven periosteum te verwijderen. Breng 3% waterstofperoxide aan op de blootgestelde schedel met behulp van een wattenstaafje gedurende ongeveer 2 s-3 s om microporiën te creëren. Spoel grondig af met steriele zoutoplossing en zorg ervoor dat het gebied volledig droog is. Maak een craniotomie met een braamgat met een diameter van 0,6 mm met behulp van een steriele, geautoclaveerde boor boven de locatie van het hersengebied, zoals bepaald door de stereotaxische atlas die is uitgelijnd met bregma en lambda. Spoel al het vuil weg met steriele zoutoplossing en zorg voor een grondige droging. Pas op dat u geen weefsel beschadigt. Steek de glasvezelhuls (implantaat) in de sondehouder en sluit deze aan op de stereotaxische arm. Lijn het implantaat direct boven het interessegebied uit met behulp van de stereotaxische arm. Wanneer u de optische vezel in het hersenweefsel inbrengt, beweegt u de vezel langzaam vooruit met een snelheid van ongeveer 2 mm/min. Meng het tandheelkundig cement om een viscositeit te bereiken die gemakkelijk over de schedel kan worden aangebracht. Gebruik een steriele tandenstoker om een dunne laag tandheelkundig cement over de schedel en op het onderste deel van het implantaat te smeren. Laat het volledig drogen. Maak de sondehouder voorzichtig los. Bereid een polypropyleen buis voor met een hoogte van 3 mm, een buitendiameter van 3 mm en een binnendiameter van 2,6 mm en snijd de buis vervolgens over de hele lengte door. Bevestig de buis met een pincet aan de onderkant van het implantaat. Giet het tandheelkundig cementpoeder in de buis en zorg voor voldoende lengte boven het implantaat om het optische vezelsignaal op te nemen. Voeg de benodigde vloeistof toe en laat het tandcement een paar minuten stollen. Zoek de opening van de pijp en klem deze voorzichtig vast om de pijp te verwijderen met een pincet. Bereid het tandheelkundig cementmengsel voor op het aanbrengen en zorg ervoor dat een gelijkmatige en dunne laag over de schedel wordt verspreid. Bedek zoveel mogelijk oppervlak op de schedel met tandheelkundig cement. Wacht een paar minuten totdat het tandheelkundig cement is gestold.NOTITIE: Laat het tandcement niet in contact komen met de huid van de muis. Boor drie gaten (1 mm diameter) in de 3D-geprinte ring, gelijkmatig verdeeld over de horizon, met een hoogte van 7 mm, een buitendiameter van 10 mm en een binnendiameter van 8,4 mm. Bevestig de schroeven (1 mm lengte) in hun respectievelijke gaten. Steek de bovenkant van het implantaat in het gat van de vooraf vervaardigde transducer. Zorg ervoor dat de binnenwand van de 3D-geprinte ring glad is en plaats deze vervolgens rond de transducer die op de schedel van de muis is geplaatst. Zorg ervoor dat de transducer gecentreerd is in de ring. Breng tandheelkundig cement aan op de overgang tussen de ring en de schedel en wacht vervolgens een paar minuten totdat het tandcement is gestold. Plaats het tandheelkundig cement niet op de verbinding tussen de transducer en de schedel. Verwijder de transducer voorzichtig en draai de schroeven stevig vast. Breng de muis over naar een warme kooi en zorg ervoor dat deze wordt bewaakt totdat deze volledig is hersteld voordat u hem terugplaatst in zijn oorspronkelijke kooi. Dien na de operatie subcutaan Carprofen (2 mg/kg) toe voor analgesie en ga elke 24 uur gedurende 3 dagen door om ontstekingen en pijn te beheersen. Controleer de dieren dagelijks op tekenen van angst, abnormaal gewichtsverlies, pijn of infectie. Normaal gesproken zouden alle muizen op de3e dag na de operatie normaal gedrag moeten vertonen. Als er na de 3edag tekenen van angst of ziekte worden waargenomen bij een muis, volg dan de institutionele richtlijnen voor euthanasie. 5. Stimulatie en signaalregistratie Schakel 7 dagen na de operatie de zuurstoftoevoer naar het gasanesthesieapparaat in en stel de zuurstofstroomregelaar in om de gasstroom in te stellen op 300-500 ml/min. Plaats de muis in de inductiekamer en sluit de toevoer van het verdovingsgas naar het masker. Draai aan de draaiknop van de verdamper om de juiste anesthesieconcentratie aan te passen (2% – 2,5%). Nadat de muis is verdoofd, plaatst u deze met een verdovingsmasker op het stereotaxische frame. Sluit de inductieleiding om het verdovingsgas in het verdovingsmasker te laten stromen. Pas de juiste concentratie van de onderhoudsanesthesie aan (1%-1,5%). Reinig het bovenoppervlak van het implantaat met alcohol en steek vervolgens het glasvezelpatchkoord in het midden van de voorbereide transducer. Injecteer water in de ruimte tussen het implantaat en de 3D-geprinte ring met behulp van een naald van 26 G en een wegwerpspuit van 1 ml om de schedel te bevochtigen. Gebruik keukenpapier om overtollig water te absorberen. Injecteer een koppelingsmiddel in de ruimte tussen het implantaat en de 3D-geprinte ring met behulp van een naald van 26 G en een wegwerpspuit van 1 ml om de gemakkelijke verspreiding van ultrageluid van de transducer naar de hersenen te vergemakkelijken. Sluit het implantaat aan op het glasvezelkoord. Steek de transducer voorzichtig in het gebied dat is gevuld met een koppelingsmiddel en draai de schroeven stevig vast. Plaats de muis in een open veld en laat hem ontwaken. Sluit de transducer aan op het ultrasone excitatiesysteem en sluit de glasvezelpatchkabel aan op het optische vezelopnamesysteem, waardoor de muis bewegingsvrijheid krijgt.LET OP: Het glasvezel patchsnoer heeft een lengte van 2m en een diameter van 1,25 mm. De lichtintensiteit voor kanaal 405 is 20 μW en voor kanaal 470 is 40 μW. Activeer zowel het ultrasone excitatieapparaat als het optische vezelopnamesysteem om ultrasone neurale modulatie te synchroniseren met de opname van optische vezelsignalen.