Neuromodulazione a ultrasuoni focalizzati simultanei e registrazione fotometrica in fibra in mouse a movimento libero

Tutte le procedure e la gestione degli animali sono state conformi alle linee guida etiche NSFC e ai requisiti del protocollo approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali del Guangdong Institute of Intelligence Science and Technology. 1. Preparazione del trasduttore Preparare una piastra piezoelettrica con un diametro interno di 3 mm, un diametro esterno di 7 mm e una frequenza centrale di 500 kHz.NOTA: Il diametro esterno può essere regolato in base alla specifica regione cerebrale presa di mira e deve essere massimizzato mantenendo la precisione della stimolazione e senza superare il limite del cranio del topo. Fissare il filo ai due lati della piastra piezoelettrica utilizzando pasta epossidica d’argento (Figura 1). Dopo che la pasta epossidica d’argento si è solidificata, utilizzare un multimetro per misurare la resistenza su entrambe le estremità del filo per assicurarsi che sia approssimativamente 0. Applicare uno strato di nastro biadesivo su una superficie di lastra di vetro pulita. Aderire saldamente alla lastra di vetro alla piastra piezoelettrica e all’anello di rame, con un’altezza di 8 mm, un diametro esterno di 8 mm e un diametro interno di 7,6 mm.NOTA: Il diametro interno dell’anello di rame è determinato dalle dimensioni della piastra piezoelettrica per garantire che la piastra sia coperta dall’anello di rame. Inserire saldamente il tubo in polipropilene con un diametro esterno di 3 mm al centro della piastra piezoelettrica e farlo aderire saldamente alla lastra di vetro (Figura 1). Preparare una quantità adeguata di colla a base di resina epossidica e aspirarla. Estrarre la resina epossidica utilizzando una siringa monouso e iniettarla lentamente nell’anello di rame. Attendere circa 10 ore fino a quando la resina epossidica si è solidificata (Figura 1). Saldare le estremità libere di due fili sul connettore del dado a baionetta utilizzando un saldatore elettronico. Rimuovere la lastra di vetro. Pulire la superficie del trasduttore con alcool (Figura 1). 2. Parametri di segnalazione per FUN Posizionare l’idrofono e il trasduttore in un serbatoio dell’acqua riempito con acqua deionizzata (Figura 2A). Assicurarsi che il raggio centrale (asse Z) del sistema di posizionamento sia allineato con l’asse del trasduttore. Questo allineamento può essere ottenuto in primo luogo, scoprendo un massimo di campo nel piano focale attraverso la scansione 2D; in secondo luogo, identificare un massimo di campo in un altro piano con un massimo chiaro; in terzo luogo, confrontando le coordinate X e Y dei due massimi e quindi regolando iterativamente la posizione e/o l’orientamento del trasduttore, se necessario28. Regolare la punta dell’idrofono con la superficie del trasduttore a una distanza di 1 mm, mantenendo costante questa distanza mentre si posiziona l’idrofono al centro del bordo destro del trasduttore. Avviare il programma di scansione per acquisire il campo acustico libero nel piano XZ (Figura 2B).NOTA: Il metodo di costruzione dell’idrofono può essere trovato in https://github.com/HQArrayLab/Hydrophone_system_control. Spostare l’idrofono lungo l’asse Z per determinare le profondità associate alla pressione di picco spaziale. In questo esperimento, la pressione di picco spaziale appare a una distanza di 3,4 mm dalla superficie del trasduttore; mantenere questa distanza quando si sposta l’idrofono nell’angolo in basso a destra del trasduttore sul piano XY. Accendere e avviare il programma di scansione per catturare il campo acustico libero nel piano XY (Figura 2B). Posizionare il trasduttore sul cranio di un topo che ha subito un intervento chirurgico come descritto al punto 4. Acquisire il campo acustico transcranico sul piano XZ e sul piano XY (Figura 2D) attraverso la scansione dell’idrofono come descritto in 2.1-2.3. Leggere le ampiezze di pressione nel punto focale, che è la regione spaziale del picco nel campo acustico libero e nel campo acustico transcranico. L’ampiezza della pressione nel punto focale nel campo acustico libero è di 730k Pa e nel campo acustico transcranico è di 580k Pa. Leggere le dimensioni focali a -3 dB (Figura 2C, E) e la posizione sui piani XY e XZ all’interno del campo acustico transcranico per valutare se il campo acustico di questo trasduttore può coprire le aree cerebrali target. Calcola l’indice meccanico (MI), che è vincolato dal documento guida della FDA a essere inferiore a 1,9 al fine di mitigare la cavitazione. Il calcolo dell’MI è dato dall’equazione:(1)dove pr,.3 rappresenta la pressione di picco rarefazionale in MPa regolata da un coefficiente di attenuazione di 0,3 dB cm-1 MHz-1, e f0 è la frequenza operativa in MHz. La pressione rarefazionale di picco del campo transcranico misurata è di 580 kPa, a 3,4 mm dal trasduttore , f0 è a 500 kHz, quindi il pr,.3 declassato è 576,6 kPa. L’MI è 0,82. Calcolare l’intensità media dell’impulso di picco spaziale (Isppa), che deve essere inferiore a 190 W/cm2 nella direzione del piano secondo il documento guida della FDA. Il calcolo dell’intensità è dato dall’equazione:(2)dove psp (t) è la pressione acustica variabile nel tempo nel punto del picco spaziale, Z è l’impedenza acustica caratteristica del mezzo (circa 1.5 x 106 Rayls per i tessuti molli) e PD è la durata dell’impulso. Nel caso dell’inviluppo quadrato, questo si riduce all’equazione:(3)dove A è l’ampiezza della pressione di picco spaziale. L’A misurato nella posizione focalizzata dell’ecografia è 580 kPa e lo Z del cervello è di circa 1,58 x 106 Rayls, quindi l’Isppa dell’involucro quadrato è 10,65 W/cm2 e l’Isppa dell’involucro sinusoidale è 10,65 W/cm2. Calcolare l’intensità media del tempo di picco spaziale (Ispta), che è vincolata dal documento guida FDA a essere inferiore a 430 mW/cm2 nella direzione del piano. Il calcolo dell’intensità è dato dall’equazione:(4)dove T è il periodo di tempo in cui viene calcolata la media. Nel caso dell’inviluppo quadrato, questo si riduce all’equazione:(5)dove iltreno di impulsi CC è il ciclo di lavoro dell’impulso. Qui, il treno di impulsi CC è dell’1% perché sono state utilizzate onde continue, quindi l’Ispta è uguale all’intensità media dell’impulso di picco spaziale, 106,5 mW/cm2 per un inviluppo quadrato. Il MI, L’SPPA e L’SPTA possono essere calcolati utilizzando il software (Figura 3A). Un codice basato su MATLAB per un facile utilizzo è disponibile all’indirizzo https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation. Riportare i parametri di temporizzazione degli impulsi, tra cui Amax, durata dell’impulso, intervallo di ripetizione degli impulsi, durata del treno di impulsi e inviluppo (Figura 3B). 3. Preparare l’animale per l’intervento chirurgico Pesare topi transgenici maschi GCaMP6s di 8 settimane, con un peso approssimativo di circa 20 g. Preparare una soluzione contenente ketamina a 10 mg/mL e xilazina a 2 mg/mL in soluzione fisiologica sterile. Somministrare la soluzione di ketamina/xilazina mediante iniezione intraperitoneale alla dose di 100 mg/kg di ketamina e 20 mg/kg di xilazina utilizzando un ago da 26 G e una siringa monouso da 1 ml. Iniziare la preparazione chirurgica una volta che l’animale non risponde a stimoli dolorosi, come il pizzicamento delle dita dei piedi. Usa un fader per tagliare i peli sulla testa dell’animale e disinfetta l’area con etanolo al 70% e iodio povidone prima della procedura chirurgica. Posiziona il mouse in posizione prona sul telaio stereotassico e assicurati che il cranio sia a livello. Metti un unguento oftalmico protettivo sugli occhi dell’animale per mantenere l’umidità. 4. Procedura chirurgica Praticare un’incisione lungo la sutura sagittale, partendo dall’osso occipitale fino all’inizio dell’osso nasale. Usa le forbici chirurgiche per rimuovere la pelle che copre entrambi gli emisferi. Utilizzare soluzione fisiologica sterile per pulire il cranio ed eliminare eventuali residui di periostio. Applicare il 3% di perossido di idrogeno sul cranio esposto utilizzando un batuffolo di cotone per circa 2 s-3 s per creare micropori. Risciacquare accuratamente con soluzione fisiologica sterile e assicurarsi che l’area sia completamente asciutta. Creare una craniotomia con foro di fresatura di 0,6 mm di diametro utilizzando una punta da trapano sterile autoclavata sopra la posizione dell’area del cervello, come determinato dall’atlante stereotassico allineato a bregma e lambda. Lavare via eventuali detriti con soluzione fisiologica sterile e garantire un’asciugatura accurata. Fare attenzione a non danneggiare alcun tessuto. Inserire la ghiera in fibra ottica (impianto) nel supporto della sonda e collegarla al braccio stereotassico. Allineare l’impianto direttamente sopra la regione di interesse utilizzando il braccio stereotassico. Quando si inserisce la fibra ottica nel tessuto cerebrale, far avanzare la fibra lentamente a una velocità di circa 2 mm/min. Mescolare il cemento dentale per ottenere una viscosità che consenta una facile applicazione su tutto il cranio. Utilizzare uno stuzzicadenti sterile per stendere un sottile strato di cemento dentale sul cranio e sulla parte inferiore dell’impianto. Lasciarlo asciugare completamente. Staccare con cautela il supporto della sonda. Preparare un tubo in polipropilene con un’altezza di 3 mm, un diametro esterno di 3 mm e un diametro interno di 2,6 mm, quindi tagliare il tubo per tutta la sua lunghezza. Fissare il tubo alla parte inferiore dell’impianto utilizzando una pinzetta. Versare la polvere di cemento dentale nel tubo assicurandosi che la lunghezza sia sufficiente sopra l’impianto per registrare il segnale della fibra ottica. Aggiungere il liquido necessario e lasciare che il cemento dentale si solidifichi per qualche minuto. Individua l’apertura del tubo e bloccala con cura per rimuovere il tubo usando una pinzetta. Preparare la miscela di cemento dentale per l’applicazione, assicurandosi che uno strato uniforme e sottile sia distribuito sul cranio. Coprire quanta più superficie possibile sul cranio con cemento dentale. Attendere qualche minuto affinché il cemento dentale si solidifichi.NOTA: Non lasciare che il cemento dentale entri in contatto con la pelle del topo. Praticare tre fori (1 mm di diametro) nell’anello stampato in 3D, divisi uniformemente all’orizzonte, con un’altezza di 7 mm, un diametro esterno di 10 mm e un diametro interno di 8,4 mm. Fissare le viti (lunghezza 1 mm) nei rispettivi fori. Inserire la parte superiore dell’impianto nel foro del trasduttore prefabbricato. Assicurati che la parete interna dell’anello stampato in 3D sia liscia, quindi posizionala attorno al trasduttore posizionato sul cranio del topo. Assicurarsi che il trasduttore sia centrato all’interno dell’anello. Applicare il cemento dentale alla giunzione tra l’anello e il cranio, quindi attendere qualche minuto affinché il cemento dentale si solidifichi. Evitare di posizionare il cemento dentale sulla connessione tra il trasduttore e il cranio. Rimuovere con cautela il trasduttore e serrare saldamente le viti. Trasferisci il mouse in una gabbia calda e assicurati che sia monitorato fino a quando non si riprende completamente prima di rimetterlo nella sua gabbia originale. Dopo l’intervento chirurgico, somministrare Carprofene per via sottocutanea (2 mg/kg) per analgesia e continuare ogni 24 ore per 3 giorni per gestire l’infiammazione e il dolore. Monitora quotidianamente gli animali per eventuali segni di angoscia, perdita di peso anormale, dolore o infezione. Normalmente, entro il 3° giorno dopo l’intervento chirurgico, tutti i topi dovrebbero mostrare un comportamento normale. Se si osservano segni di sofferenza o malattia in un topo dopo il 3° giorno, seguire le linee guida istituzionali per l’eutanasia. 5. Stimolazione e registrazione del segnale A 7 giorni dall’intervento, attivare l’alimentazione di ossigeno alla macchina per anestesia gassosa e regolare il regolatore del flusso di ossigeno per impostare il flusso di gas a 300-500 ml/min. Posizionare il mouse nella camera di induzione e chiudere l’erogazione del gas anestetico alla maschera. Ruotare la manopola del vaporizzatore per regolare la concentrazione di anestetico appropriata (2%- 2,5%). Dopo che il topo è stato anestetizzato, posizionarlo sul telaio stereotassico con una maschera anestetica. Chiudere la linea di induzione per far fluire il gas anestetico nella maschera anestetica. Regolare la concentrazione di anestetico di mantenimento appropriata (1%-1,5%). Pulire la superficie superiore dell’impianto con alcool, quindi inserire il cavo patch in fibra ottica al centro del trasduttore preparato. Iniettare acqua nello spazio tra l’impianto e l’anello stampato in 3D utilizzando un ago da 26 G e una siringa monouso da 1 ml per inumidire il cranio. Usa salviette di carta per assorbire l’acqua in eccesso. Iniettare un agente di accoppiamento nello spazio tra l’impianto e l’anello stampato in 3D utilizzando un ago da 26 G e una siringa monouso da 1 ml per facilitare la facile propagazione degli ultrasuoni dal trasduttore al cervello. Collegare l’impianto al cavo patch in fibra ottica. Inserire con cautela il trasduttore nell’area riempita con un agente di accoppiamento e serrare saldamente le viti. Posiziona il mouse in un campo aperto e lascialo svegliare. Collegare il trasduttore al sistema di eccitazione ultrasonica e collegare il cavo patch in fibra ottica al sistema di registrazione in fibra ottica, consentendo libertà di movimento per il mouse.NOTA: Il cavo patch in fibra ottica ha una lunghezza di 2 m e un diametro di 1,25 mm. L’intensità luminosa per il canale 405 è di 20 μW e per il canale 470 è di 40 μW. Attivare sia il dispositivo di eccitazione ultrasonica che il sistema di registrazione in fibra ottica per sincronizzare la modulazione neurale ultrasonica con la registrazione del segnale in fibra ottica.