Enregistrement simultané de neuromodulation par ultrasons focalisés et de photométrie par fibre chez une souris en mouvement libre

Toutes les procédures et la manipulation des animaux étaient conformes aux directives éthiques de la NSFC et aux exigences du protocole approuvé par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Institut du renseignement, de la science et de la technologie du Guangdong. 1. Préparation de la sonde Préparez une plaque piézoélectrique d’un diamètre intérieur de 3 mm, d’un diamètre extérieur de 7 mm et d’une fréquence centrale de 500 kHz.REMARQUE : Le diamètre extérieur peut être ajusté en fonction de la région cérébrale spécifique ciblée et doit être maximisé tout en maintenant la précision de la stimulation et sans dépasser la limite du crâne de la souris. Fixez le fil aux deux côtés de la plaque piézoélectrique à l’aide de pâte époxy-argent (Figure 1). Une fois que la pâte d’argent époxy s’est solidifiée, utilisez un multimètre pour mesurer la résistance aux deux extrémités du fil afin de vous assurer qu’elle est d’environ 0. Appliquez une couche de ruban adhésif double face sur une surface de feuille de verre propre. Collez fermement à la plaque piézoélectrique et à l’anneau de cuivre, d’une hauteur de 8 mm, d’un diamètre extérieur de 8 mm et d’un diamètre intérieur de 7,6 mm, à la feuille de verre.REMARQUE : Le diamètre intérieur de l’anneau de cuivre est déterminé par la taille de la plaque piézoélectrique pour s’assurer que la plaque est recouverte par l’anneau de cuivre. Insérez solidement le tuyau en polypropylène d’un diamètre extérieur de 3 mm au centre de la plaque piézoélectrique et collez-le fermement à la feuille de verre (Figure 1). Préparez une quantité appropriée de colle à base de résine époxy et aspirez-la. Extrayez l’époxy à l’aide d’une seringue jetable et injectez-le lentement dans l’anneau de cuivre. Attendez environ 10 h jusqu’à ce que l’époxy se soit solidifié (Figure 1). Soudez les extrémités libres de deux fils sur le connecteur de l’écrou à baïonnette à l’aide d’un fer à souder électronique. Retirez la feuille de verre. Nettoyez la surface de la sonde avec de l’alcool (Figure 1). 2. Paramètres de signalement pour FUN Placez l’hydrophone et le transducteur dans un réservoir d’eau rempli d’eau déminéralisée (Figure 2A). Assurez-vous que le faisceau central (axe Z) du système de positionnement est aligné avec l’axe de la sonde. Cet alignement peut être réalisé en découvrant d’abord un maximum de champ dans le plan focal grâce au balayage 2D ; deuxièmement, l’identification d’un maximum de champ dans un autre plan avec un maximum clair ; troisièmement, comparer les coordonnées X et Y des deux maxima, puis ajuster itérativement la position et/ou l’orientation du transducteur si nécessaire28. Ajustez l’extrémité de l’hydrophone avec la surface du transducteur à une distance de 1 mm, en maintenant cette distance constante tout en positionnant l’hydrophone au milieu du bord droit du transducteur. Lancez le programme de balayage pour capturer le champ acoustique libre dans le plan XZ (Figure 2B).REMARQUE : La méthode de construction de l’hydrophone peut être trouvée à https://github.com/HQArrayLab/Hydrophone_system_control. Déplacez l’hydrophone le long de l’axe Z pour déterminer les profondeurs associées à la pression de pointe spatiale. Dans cette expérience, la pression de crête spatiale apparaît à une distance de 3,4 mm de la surface du transducteur ; maintenez cette distance lorsque vous déplacez l’hydrophone dans le coin inférieur droit du transducteur dans le plan XY. Mettez sous tension et lancez le programme de balayage pour capturer le champ acoustique libre dans le plan XY (Figure 2B). Placez le transducteur sur le crâne d’une souris qui a subi une intervention chirurgicale comme décrit à l’étape 4. Acquérir le champ acoustique transcrânien sur le plan XZ et le plan XY (Figure 2D) par balayage hydrophonique comme décrit en 2.1-2.3. Lire les amplitudes de pression au point focal, qui est la région de pic spatial dans le champ acoustique libre et le champ acoustique transcrânien. L’amplitude de pression au point focal dans le champ acoustique libre est de 730k Pa, et dans le champ acoustique transcrânien est de 580k Pa. Lire les dimensions focales à -3 dB (Figure 2C, E) et la position sur les plans XY et XZ dans le champ acoustique transcrânien pour évaluer si le champ acoustique de ce transducteur peut couvrir les zones cérébrales cibles. Calculez l’indice mécanique (MI), qui est limité par le document d’orientation de la FDA à être inférieur à 1,9 afin d’atténuer la cavitation. Le calcul de l’IM est donné par l’équation :(1)où pr,.3 représente la pression de raréfaction de crête en MPa ajustée par un coefficient d’affaiblissement de 0,3 dB cm-1 MHz-1, et f0 est la fréquence de fonctionnement en MHz. La pression de raréfaction de crête du champ transcrânien mesurée est de 580 kPa, , à 3,4 mm du transducteur, le f0 est de 500 kHz, de sorte que le pr,.3 déclassé est de 576,6 kPa. L’IM est de 0,82. Calculez l’intensité moyenne d’impulsion de crête spatiale (Isppa), qui doit être inférieure à 190 W/cm2 dans la direction du plan conformément au document d’orientation de la FDA. Le calcul de l’intensité est donné par l’équation :(2)où psp (t) est la pression acoustique variant dans le temps à l’emplacement du pic spatial, Z est l’impédance acoustique caractéristique du milieu (environ 1.5 x 106 Rayls pour les tissus mous), et est la durée d’impulsion. Dans le cas de l’enveloppe carrée, cela se réduit à l’équation suivante :(3)où A est l’amplitude de la pression de crête spatiale. Le A mesuré à l’emplacement focalisé par ultrasons est de 580 kPa, et le Z du cerveau est d’environ 1,58 x 106 Rayls, donc le Isppa de l’enveloppe carrée est de 10,65 W/cm2 et le Isppa de l’enveloppe sinusoïdale est de 10,65 W/cm2. Calculez l’intensité moyenne temporelle de crête spatiale (Ispta), qui est contrainte par le document d’orientation de la FDA comme étant inférieure à 430 mW/cm2 dans la direction du plan. Le calcul de l’intensité est donné par l’équation :(4)où T est la période sur laquelle la moyenne est calculée. Dans le cas de l’enveloppe carrée, cela se réduit à l’équation suivante :(5)oùle train d’impulsions CC est le rapport cyclique de l’impulsion. Ici, le train d’impulsions DC est de 1% car des ondes continues ont été utilisées, de sorte que le I spta est égal à l’intensité moyenne de l’impulsion de crête spatiale, soit 106,5 mW/cm2 pour une enveloppe carrée. Les valeurs MI, Isppa et Ispta peuvent être calculées à l’aide du logiciel (Figure 3A). Un code basé sur MATLAB pour une utilisation facile est disponible à l’adresse https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation. Indiquez les paramètres de synchronisation des impulsions, y compris Amax, la durée des impulsions, l’intervalle de répétition des impulsions, la durée du train d’impulsions et l’enveloppe (Figure 3B). 3. Préparation de l’animal à la chirurgie Peser des souris transgéniques mâles GCaMP6s âgées de 8 semaines, d’un poids approximatif d’environ 20 g. Préparez une solution contenant de la kétamine à 10 mg/mL et de la xylazine à 2 mg/mL dans une solution saline stérile. Administrer la solution de kétamine/xylazine par injection intrapéritonéale à une dose de 100 mg/kg de kétamine et de 20 mg/kg de xylazine à l’aide d’une aiguille de 26 g et d’une seringue jetable de 1 ml. Commencer la préparation chirurgicale une fois que l’animal ne répond plus aux stimuli douloureux, comme le pincement des orteils. Utilisez un fader pour couper les poils de la tête de l’animal et désinfectez la zone avec de l’éthanol à 70 % et de la povidone iodée avant l’intervention chirurgicale. Placez la souris en position couchée sur le cadre stéréotaxique et assurez-vous que le crâne est de niveau. Placez une pommade ophtalmique protectrice sur les yeux de l’animal pour maintenir l’hydratation. 4. Intervention chirurgicale Faites une incision le long de la suture sagittale, en partant de l’os occipital jusqu’au début de l’os nasal. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour enlever la peau recouvrant les deux hémisphères. Utilisez une solution saline stérile pour nettoyer le crâne et éliminer tout périoste restant. Appliquez du peroxyde d’hydrogène à 3 % sur le crâne exposé à l’aide d’un coton-tige pendant environ 2 à 3 s pour créer des micropores. Rincez abondamment avec une solution saline stérile et assurez-vous que la zone est complètement sèche. Créez une craniotomie à trou de fraise de 0,6 mm de diamètre à l’aide d’un foret stérile autoclavé au-dessus de l’emplacement de la zone du cerveau, tel que déterminé par l’atlas stéréotaxique aligné sur bregma et lambda. Lavez tous les débris avec une solution saline stérile et assurez-vous qu’ils sèchent soigneusement. Veillez à ne pas endommager les tissus. Insérez la virole à fibre optique (implant) dans le support de sonde et connectez-la au bras stéréotaxique. Alignez l’implant directement au-dessus de la région d’intérêt à l’aide du bras stéréotaxique. Lors de l’insertion de la fibre optique dans le tissu cérébral, avancez lentement la fibre à une vitesse d’environ 2 mm/min. Mélangez le ciment dentaire pour obtenir une viscosité qui permet une application facile sur le crâne. À l’aide d’un cure-dent stérile, étalez une fine couche de ciment dentaire sur le crâne et sur la partie inférieure de l’implant. Laissez-le sécher complètement. Détachez soigneusement le support de la sonde. Préparez un tuyau en polypropylène d’une hauteur de 3 mm, d’un diamètre extérieur de 3 mm et d’un diamètre intérieur de 2,6 mm, puis coupez le tuyau sur toute sa longueur. Fixez le tuyau au bas de l’implant à l’aide d’une pince à épiler. Versez la poudre de ciment dentaire dans le tuyau en assurant une longueur suffisante au-dessus de l’implant pour l’enregistrement du signal de la fibre optique. Ajoutez le liquide requis et laissez le ciment dentaire se solidifier quelques minutes. Localisez l’ouverture du tuyau et fixez-le soigneusement pour retirer le tuyau à l’aide d’une pince à épiler. Préparez le mélange de ciment dentaire pour l’application, en veillant à ce qu’une couche uniforme et mince soit répartie sur le crâne. Couvrez autant de surface que possible sur le crâne avec du ciment dentaire. Attendez quelques minutes que le cémenton dentaire se solidifie.REMARQUE : Ne laissez pas le ciment dentaire entrer en contact avec la peau de la souris. Percez trois trous (1 mm de diamètre) dans l’anneau imprimé en 3D, uniformément répartis à l’horizon, d’une hauteur de 7 mm, d’un diamètre extérieur de 10 mm et d’un diamètre intérieur de 8,4 mm. Fixez les vis (longueur 1 mm) dans leurs trous respectifs. Insérez le haut de l’implant dans le trou du transducteur préfabriqué. Assurez-vous que la paroi intérieure de l’anneau imprimé en 3D est lisse, puis placez-la autour de la sonde positionnée sur le crâne de la souris. Assurez-vous que la sonde est centrée dans l’anneau. Appliquez du ciment dentaire à la jonction entre l’anneau et le crâne, puis attendez quelques minutes que le ciment dentaire se solidifie. Évitez de placer le ciment dentaire sur la connexion entre le transducteur et le crâne. Retirez délicatement le transducteur et serrez fermement les vis. Transférez la souris dans une cage chaude et assurez-vous qu’elle est surveillée jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie avant de la remettre dans sa cage d’origine. Après la chirurgie, administrer du carprofène sous-cutané (2 mg/kg) pour l’analgésie et continuer toutes les 24 heures pendant 3 jours pour gérer l’inflammation et la douleur. Surveillez quotidiennement les animaux pour détecter tout signe de détresse, de perte de poids anormale, de douleur ou d’infection. Normalement, au 3ejour après l’opération, toutes les souris devraient présenter un comportement normal. Si des signes de détresse ou de maladie sont observés chez une souris après le3e jour, suivez les directives de l’établissement pour l’euthanasie. 5. Stimulation et enregistrement du signal À 7 jours après la chirurgie, ouvrez l’alimentation en oxygène de l’appareil d’anesthésie gazeuse et ajustez le régulateur de débit d’oxygène pour régler le débit de gaz à 300-500 ml/min. Placez la souris dans la chambre d’induction et fermez l’administration de gaz anesthésique dans le masque. Tournez le cadran du vaporisateur pour régler la concentration d’anesthésique appropriée (2 % à 2,5 %). Une fois la souris anesthésiée, placez-la sur le cadre stéréotaxique à l’aide d’un masque anesthésique. Fermez la ligne d’induction pour laisser le gaz anesthésique s’écouler dans le masque anesthésique. Ajustez la concentration appropriée de l’anesthésique d’entretien (1 % à 1,5 %). Nettoyez la surface supérieure de l’implant avec de l’alcool, puis insérez le cordon de raccordement à fibre optique au centre du transducteur préparé. Injectez de l’eau dans l’espace entre l’implant et l’anneau imprimé en 3D à l’aide d’une aiguille 26G et d’une seringue jetable de 1 ml pour humidifier le crâne. Utilisez des serviettes en papier pour absorber l’excès d’eau. Injectez un agent de couplage dans l’espace entre l’implant et l’anneau imprimé en 3D à l’aide d’une aiguille 26G et d’une seringue jetable de 1 ml pour faciliter la propagation des ultrasons du transducteur vers le cerveau. Connectez l’implant au cordon de raccordement à fibre optique. Insérez soigneusement le transducteur dans la zone remplie d’un agent de couplage et serrez fermement les vis. Placez la souris dans un champ ouvert et laissez-la se réveiller. Fixez le transducteur au système d’excitation par ultrasons et connectez le cordon de raccordement à fibre optique au système d’enregistrement à fibre optique, permettant ainsi à la souris de se déplacer sans aucun mouvement.REMARQUE : Le cordon de raccordement à fibre optique a une longueur de 2 m et un diamètre de 1,25 mm. L’intensité lumineuse du canal 405 est de 20 μW et celle du canal 470 est de 40 μW. Activez à la fois le dispositif d’excitation par ultrasons et le système d’enregistrement par fibre optique afin de synchroniser la modulation neuronale par ultrasons avec l’enregistrement du signal par fibre optique.