Одновременная нейромодуляция сфокусированного ультразвука и запись оптоволоконной фотометрии в свободно движущейся мыши

Все процедуры и обращение с животными соответствовали этическим рекомендациям NSFC и утвержденным протокольным требованиям Комитета по уходу за животными и их использованию Гуандунского института разведки, науки и технологий. 1. Подготовка преобразователя Подготовьте пьезоэлектрическую пластину с внутренним диаметром 3 мм, внешним диаметром 7 мм и центральной частотой 500 кГц.ПРИМЕЧАНИЕ: Внешний диаметр может быть отрегулирован в зависимости от конкретной области мозга, на которую воздействует, и должен быть максимальным, сохраняя точность стимуляции и не выходя за границу черепа мыши. Прикрепите провод к двум сторонам пьезоэлектрической пластины с помощью эпоксидной серебряной пасты (рис. 1). После того, как эпоксидная серебряная паста застынет, используйте мультиметр для измерения сопротивления на обоих концах провода, чтобы убедиться, что оно составляет примерно 0. Нанесите слой двустороннего скотча на поверхность чистого стеклянного листа. Плотно приклейте к стеклянному листу пьезоэлектрическую пластину и медное кольцо высотой 8 мм, внешним диаметром 8 мм и внутренним диаметром 7,6 мм.ПРИМЕЧАНИЕ: Внутренний диаметр медного кольца определяется размером пьезоэлектрической пластины, чтобы убедиться, что пластина покрыта медным кольцом. Надежно вставьте полипропиленовую трубу с наружным диаметром 3 мм в центр пьезоэлектрической пластины и прочно приклейте ее к стеклянному листу (рисунок 1). Приготовьте соответствующее количество клея на основе эпоксидной смолы и пропылесосьте его. Извлеките эпоксидную смолу с помощью одноразового шприца и медленно введите ее в медное кольцо. Подождите около 10 часов, пока эпоксидная смола не затвердеет (Рисунок 1). Припаяйте свободные концы двух проводов к разъему байонетной гайки с помощью электронного паяльника. Снимите стеклянный лист. Очистите поверхность датчика спиртом (Рисунок 1). 2. Параметры отчетности для FUN Поместите гидрофон и датчик в резервуар для воды, наполненный деионизированной водой (рисунок 2A). Убедитесь, что центральный луч (ось Z) системы позиционирования совмещен с осью преобразователя. Это выравнивание может быть достигнуто путем, во-первых, обнаружения максимума поля в фокальной плоскости с помощью 2D-сканирования; во-вторых, выявление максимума поля в другой плоскости с четким максимумом; в-третьих, сравнение координат X и Y двух максимумов и последующая итеративная корректировка положения и/или ориентации преобразователя, если это необходимо28. Отрегулируйте наконечник гидрофона относительно поверхности датчика на расстоянии 1 мм, сохраняя это расстояние постоянным при расположении гидрофона посередине правого края датчика. Запустите программу сканирования для захвата свободного акустического поля в плоскости XZ (рис. 2B).ПРИМЕЧАНИЕ: С методом построения гидрофона можно ознакомиться в https://github.com/HQArrayLab/Hydrophone_system_control. Переместите гидрофон вдоль оси Z, чтобы определить глубины, связанные с пространственным пиковым давлением. В этом эксперименте пространственное пиковое давление появляется на расстоянии 3,4 мм от поверхности преобразователя; сохранять это расстояние при перемещении гидрофона в правый нижний угол преобразователя в плоскости XY. Включите и запустите программу сканирования для захвата свободного акустического поля в плоскости XY (рис. 2B). Поместите датчик на череп мыши, перенесшей операцию, как описано в шаге 4. Получите транскраниальное акустическое поле в плоскости XZ и плоскости XY (рис. 2D) с помощью сканирования гидрофона, как описано в пунктах 2.1-2.3. Считывание амплитуд давления в фокусной точке, которая является пространственной пиковой областью в свободном акустическом поле и транскраниальном акустическом поле. Амплитуда давления в фокусной точке в свободном акустическом поле составляет 730 кПа, а в транскраниальном акустическом поле — 580 кПа. Прочтите фокусные размеры при -3 дБ (рис. 2C,E) и положение на плоскостях XY и XZ в транскраниальном акустическом поле, чтобы оценить, может ли акустическое поле этого преобразователя покрыть целевые области мозга. Рассчитайте механический индекс (MI), который в соответствии с руководящим документом FDA должен быть ниже 1,9, чтобы смягчить кавитацию. Расчет MI задается уравнением:(1)где pr,.3 представляет собой пиковое разрежающее давление в МПа, скорректированное на коэффициент затухания 0,3 дБ см-1 МГц-1, а f0 – рабочая частота в МГц. Измеренное пиковое разрежающее давление в транскраниальном поле составляет 580 кПа, , в 3,4 мм от преобразователя, f0 равно 500 кГц, поэтому пониженное pr,.3 составляет 576,6 кПа. ИМ составляет 0,82. Рассчитайте пространственно-пиковую среднюю интенсивность пульса (Isppa), которая должна быть ниже 190 Вт/см2 в плоскостном направлении в соответствии с руководящим документом FDA. Расчет интенсивности задается уравнением:(2)где psp (t) — изменяющееся во времени акустическое давление в месте пространственного пика, Z — характеристическое акустическое сопротивление среды (приблизительно 1.5 x 106 Рэйл для мягких тканей), а PD — длительность пульса. В случае квадратной оболочки это сводится к уравнению:(3)где A — амплитуда пространственного пикового давления. Значение А, измеренное в месте фокусировки ультразвука, составляет 580 кПа, а Z мозга составляет около 1,58 х 106 Райл, таким образом, Isppa квадратной оболочки составляет 10,65 Вт/см2 , а Isppa синусоидальной оболочки составляет 10,65 Вт/см2. Рассчитайте пространственно-пиковую средневременную интенсивность (Ispta), которая ограничена руководящим документом FDA и должна быть ниже 430 мВт/см2 в горизонтальном направлении. Расчет интенсивности задается уравнением:(4)где T — период времени, за который вычисляется среднее значение. В случае квадратной оболочки это сводится к уравнению:(5)гдепоследовательность импульсов постоянного тока — скважность импульса. Здесь последовательность импульсов постоянного тока равна 1%, так как использовались непрерывные волны, поэтому Ispta равна средней интенсивности пространственного пика, 106,5 мВт/см2 для квадратной огибающей. MI, Isppa и Ispta могут быть рассчитаны с помощью программного обеспечения (рис. 3A). Код на основе MATLAB для простого использования можно найти на https://github.com/HQArrayLab/Ultrasound_Parameter_Caculation. Сообщите параметры синхронизации импульса, включая Amax, длительность импульса, интервал повторения импульсов, длительность последовательности импульсов и огибающую (рис. 3B). 3. Подготовка животного к операции Весят 8-недельные самцы трансгенных мышей GCaMP6s, с приблизительным весом около 20 г. Приготовьте раствор, содержащий кетамин в дозе 10 мг/мл и ксилазин в дозе 2 мг/мл в стерильном физрастворе. Вводите раствор кетамина/ксилазина путем внутрибрюшинной инъекции в дозировке 100 мг/кг кетамина и 20 мг/кг ксилазина с помощью иглы 26G и одноразового шприца объемом 1 мл. Начинайте хирургическую подготовку, когда животное перестает реагировать на болезненные раздражители, такие как защемление пальца ноги. Перед хирургическим вмешательством используйте фейдер для стрижки шерсти на голове животного и продезинфицируйте область с помощью 70% этанола и повидон-йода. Поместите мышь в положение лежа на стереотаксической раме и убедитесь, что череп находится на одном уровне. Нанесите защитную офтальмологическую мазь на глаза животного для поддержания влажности. 4. Хирургическое вмешательство Сделайте надрез вдоль сагиттального шва, начиная от затылочной кости до начала носовой кости. С помощью хирургических ножниц удалите кожу, покрывающую оба полушария. Используйте стерильный физиологический раствор для очищения черепа и устранения остатков надкостницы. Нанесите 3% перекись водорода на обнаженный череп с помощью ватного тампона примерно на 2 с-3 с, чтобы создать микропоры. Тщательно промойте стерильным физиологическим раствором и убедитесь, что область полностью сухая. Создайте краниотомию с отверстием в заусенце диаметром 0,6 мм с помощью стерильного автоклавного сверла над областью мозга, определенной по стереотаксическому атласу, выровненному по брегме и лямбде. Смойте мусор стерильным физиологическим раствором и обеспечьте тщательную сушку. Будьте осторожны, чтобы не повредить ткани. Вставьте волоконно-оптический наконечник (имплантат) в держатель щупа и подключите его к стереотаксическому кронштейну. Выровняйте имплантат непосредственно над исследуемой областью с помощью стереотаксического кронштейна. При введении оптического волокна в ткань мозга продвигайте волокно медленно со скоростью примерно 2 мм/мин. Смешайте стоматологический цемент до достижения вязкости, позволяющей легко наносить его на череп. С помощью стерильной зубочистки нанесите тонкий слой стоматологического цемента на череп и на нижнюю часть имплантата. Дайте ему полностью высохнуть. Осторожно отсоедините держатель щупа. Подготовьте полипропиленовую трубу высотой 3 мм, внешним диаметром 3 мм и внутренним диаметром 2,6 мм, а затем разрежьте трубу по всей ее длине. Прикрепите трубу к нижней части имплантата с помощью пинцета. Насыпьте порошок стоматологического цемента в трубу, обеспечивающую достаточную длину над имплантатом для регистрации сигнала оптического волокна. Добавьте необходимую жидкость и дайте несколько минут стоматологическому цементу застыть. Найдите отверстие трубы и аккуратно зажмите его, чтобы извлечь трубу с помощью пинцета. Подготовьте смесь стоматологического цемента для нанесения, обеспечив равномерное нанесение тонкого слоя на череп. Покройте как можно большую площадь поверхности черепа стоматологическим цементом. Подождите несколько минут, пока стоматологический цемент застынет.ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте контакта стоматологического цемента с кожей мыши. Просверлите три отверстия (диаметром 1 мм) в напечатанном на 3D-принтере кольце, равномерно разделенном на горизонте, высотой 7 мм, внешним диаметром 10 мм и внутренним диаметром 8,4 мм. Закрепите винты (длиной 1 мм) в соответствующих отверстиях. Вставьте верхнюю часть имплантата в отверстие предварительно изготовленного датчика. Убедитесь, что внутренняя стенка напечатанного на 3D-принтере кольца гладкая, а затем поместите его вокруг датчика, расположенного на черепе мыши. Убедитесь, что преобразователь расположен по центру кольца. Нанесите стоматологический цемент на стык между кольцом и черепом, затем подождите несколько минут, пока стоматологический цемент застынет. Избегайте установки стоматологического цемента на соединение между датчиком и черепом. Осторожно снимите преобразователь и надежно затяните винты. Переложите мышь в теплую клетку и убедитесь, что она находится под наблюдением до полного восстановления, прежде чем возвращать ее в исходную клетку. После операции введите подкожно карпрофен (2 мг/кг) для обезболивания и продолжайте каждые 24 часа в течение 3 дней для снятия воспаления и боли. Ежедневно наблюдайте за животными на предмет любых признаков стресса, аномальной потери веса, боли или инфекции. Как правило, к3-му дню после операции все мыши должны демонстрировать нормальное поведение. Если после3-го дня у мыши наблюдаются какие-либо признаки дистресса или болезни, следуйте рекомендациям учреждения по эвтаназии. 5. Стимуляция и запись сигнала Через 7 дней после операции включите подачу кислорода в аппарат для газовой анестезии и отрегулируйте регулятор потока кислорода так, чтобы он был установлен на уровне 300-500 мл/мин. Поместите мышь в индукционную камеру и закройте подачу анестетика к маске. Поверните диск испарителя, чтобы отрегулировать соответствующую концентрацию анестетика (2%-2,5%). После того, как мышь будет обезболива, поместите ее на стереотаксическую рамку с анестезирующей маской. Закройте индукционную линию, чтобы анестетик поступал в маску для анестезии. Отрегулируйте соответствующую концентрацию поддерживающего анестетика (1%-1,5%). Очистите верхнюю поверхность имплантата спиртом, а затем вставьте волоконно-оптический патч-корд в центр подготовленного датчика. Введите воду в пространство между имплантатом и напечатанным на 3D-принтере кольцом с помощью иглы 26G и одноразового шприца объемом 1 мл для увлажнения черепа. Используйте бумажные полотенца, чтобы впитать лишнюю воду. Введите связующее вещество в пространство между имплантатом и напечатанным на 3D-принтере кольцом с помощью иглы 26G и одноразового шприца объемом 1 мл, чтобы облегчить распространение ультразвука от датчика к мозгу. Подсоедините имплантат к оптоволоконному патч-корду. Осторожно вставьте преобразователь в область, которая заполнена соединительным веществом, и надежно затяните винты. Поместите мышь в открытое поле и дайте ей проснуться. Подключите датчик к системе ультразвукового возбуждения и подключите оптоволоконный патч-корд к оптоволоконной системе записи, чтобы обеспечить свободу движений мыши.ПРИМЕЧАНИЕ: Волоконно-оптический патч-корд имеет длину 2 м и диаметр 1,25 мм. Интенсивность света для канала 405 составляет 20 μВт, а для канала 470 — 40 μВт. Активируйте как ультразвуковое возбуждающее устройство, так и оптоволоконную систему регистрации для синхронизации ультразвуковой нейронной модуляции с регистрацией оптоволоконного сигнала.