蛍光In Situハイブリダイゼーションによるホルマリン固定パラフィン包埋サンプルにおける遺伝子増幅のロバスト検出

この研究プロトコルは、テキサス大学サウスウェスタンメディカルセンターの治験審査委員会(IRB)によって承認されました。手術前にすべての患者からインフォームドコンセントが得られました。 1. 試薬・材料調製 8.212 mLのHCl(37% w/wまたは12.1 N)を491.788 mLのddH2Oにゆっくりと加えて、ドラフト内で0.2 Nの塩化ナトリウム(HCl)溶液を調製します。注意: 水に酸をゆっくりと加えます。酸に水を加えないでください。 1.47 gのクエン酸三ナトリウム(二水和物)を400 mLのddH2Oに溶解して、10 mMクエン酸溶液(pH 6.0)を調製します。HClを使用してpH 6.0に調整し、最終容量をddH2Oで500 mLにします。バッファーをRTで保存します。 100 μL の Tween-20 を 900 μL の ddH2O に加えて、10% Tween-20 溶液を調製します。 5 mLのIGEPAL CA-630を45 mLのddH2Oに加えて、10% IGEPAL溶液を調製します。 44.1 gの三ナトリウム(二水和物)と87.65 gの塩化ナトリウム(NaCl)を900 mLのddH2Oに溶解して、20x SSC(pH 7.0、3 M NaCl、0.3 Mクエン酸ナトリウム)溶液を調製します。HClを使用してpH 7.0に調整し、最終容量をddH2Oで1000 mLにします。緩衝液をRTで保存します。 100 mLの20x SSCを900 mLのddH2Oに加えて、2x SSC溶液を調製します。必要に応じて、0.5mLの防腐剤を加えます(材料表)。RTで保管してください。 910 μL の ddH2O、500 μL の 20x SSC、50 μL の 10% Tween-20、40 μL の RNase A、1 mL の 50% デキストラン硫酸塩、および 2.5 mL のホルムアミドを混合して、プローブハイブリダイゼーションバッファーを調製します。1mLに分量し、-20°Cで保存します。 100 mLの2x SSC、15 mLの10% IGEPAL、および385 mLのddH2Oを混合して、0.3% IGEPAL溶液で0.4x SSCを調製します。 5 mLの10% IGEPALを495 mLの2x SSC溶液に加えて、0.1% IGEPAL溶液で2x SSCを調製します。RTで保管してください。 使用前に、1 μLのProteinase Kを99 μLのTris-EDTAバッファーに加えて、Proteinase K消化バッファーを新たに調製します。 1 mgのDAPIを1 mLのddH2Oに溶解して、1 mg/mLのDAPI保存ストックを調製します。-20°Cで光を避けて保存します。2x SSC溶液999 μLにDAPI保存ストック1 μLを加えて、DAPIワーキング溶液を調製します。使用するまで光を避けてください。 2.サンプルの前処理 注:ここで使用しているスライドには試験片が含まれています。 スライドを60〜90°Cで20分間または一晩熟成させます(図1)。注:このステップにより、パラフィンの融解が容易になります。通常、20分の加熱で十分です。スケジュールに合わせて一晩に延長することができます。 スライドをキシレンまたはその代替品にCoplinジャーに10分間浸して脱パラフィンします。新鮮なキシレンまたはその代替品でこの手順を繰り返します。Coplinジャーで次のすべての前処理および洗浄手順を実行します。注:キシレン代替品は、キシレンの安全で環境に優しい代替品です。代替品の1つ( 材料の表を参照)は、キシレンと同等に、またはそれ以上に機能します。キシレン代替品はキシレンよりも臭いが少ないですが、ドラフト内での使用をお勧めします。キシレン代替品にアクセスできない場合、すべての手順は、変更なしでキシレンベースの脱パラフィン処理に適合します。 キシレン代替品を100%エタノールで5分間洗い流します。 スライドを70%エタノール浸漬で5分間再水和します。 スライドを0.2 N塩酸(HCl)に室温で20分間浸漬します。注:HClは、塩基性核タンパク質などの酸可溶性タンパク質を効果的に抽出して、FISHプローブ11へのDNAアクセシビリティを改善します。 スライドを10 mMの高温クエン酸溶液に浸し、90〜95°Cで20分間インキュベートします。注:高温下でのクエン酸処理は、同様に酸可溶性タンパク質を抽出します。どちらの酸処理も、細胞外マトリックスタンパク質を抽出して自家蛍光を減少させると考えられています12。クエン酸溶液をスライドに塗布する前に、目的の温度範囲に予熱することをお勧めします。電子レンジはそのための便利な方法です。真空調理器などのウォーターバスは、高温インキュベーションに最も効果的で経済的なソリューションです。 スライドを2x SSCで短時間すすぎ、pHを中和します。 100-200 μL(切片のサイズによっては組織を完全に覆う程度)のProteinase K消化バッファーを添加して組織を消化し、室温で1分間インキュベートします。注:プロテイナーゼK消化は、FISHプローブのアクセシビリティをさらに向上させ、自家蛍光を減少させます。消化時間は、組織の種類に基づいて最適化する必要があります。ほとんどの場合、1分間の消化で十分です。過剰消化はハロー状の核形態につながり、消化時間を短縮する必要があります。 プロテイナーゼKの消化を直ちに停止し、スライドを70%エタノールに2分間浸漬して脱水し、続いて85%および100%エタノール処理をそれぞれ2分間行います。 3. FISHとイメージング 2 μL の FISH プローブストックを 8 μL のハイブリダイゼーションバッファーで希釈して FISH ハイブリダイゼーションミックスを調製し、スライドに適用します。サンプルをカバースリップで覆います。注:使用されるFISHプローブの合計ストックは、画質に応じて0.5〜4μLの範囲です。信号が低すぎる場合は、プローブ入力を増やします。バックグラウンドが高すぎる場合、特に核の外側に蛍光破片が観察される場合は、FISHプローブの入力を減らしてください。ハイブリダイゼーションバッファーは、市販のプローブに付属するものでも、セクション1のように調製したものでもよい。 スライドをスライドモートハイブリダイゼーションシステムなどのホットプレートに置き、DNAを75°Cで2〜5分間変性させます。次に、スライドを37°Cに設定された別のホットプレートに移し、一晩でハイブリダイズします。注意: ホットプレートにハイブリダイゼーション中に湿度を維持するためのウォータートレイまたはリザーバーがある場合、カバースリップをゴムセメントでシールする必要はありません。 ハイブリダイゼーション後、スライドを0.3% IGEPAL CA-630洗浄バッファーを含む40〜60°C温めた0.4x SSCに浸し、カバースリップを慎重に取り外します。暗闇の中でそれぞれ5分間、最初の10〜15秒間攪拌しながら、洗浄を2回続けます。注意: スライドを洗浄バッファーに浸すと、カバースリップが静かに解放されます。 スライドをSSCで0.1%IGEPAL CA-630を使用して、暗闇のRTで5分間洗浄し、最初の10〜15秒間攪拌します。 自家蛍光をクエンチするには、スライドを自家蛍光クエンチングキット( 材料表を参照)で150 μLの試薬(50 μL + 50 μL + 50 μL の試薬A、B、C)を2〜5分間適用し、2x SSCで5分間洗浄します。注: これはオプションの手順です。組織の自家蛍光は、主にコラーゲンやエラスチンなどの細胞外マトリックス成分に由来します。また、リソソームやミトコンドリアにはリポフスチン、NADPH、フラビン補酵素が含まれているため、その影響も大きく受けます。アルデヒドの固定と血球の存在も自家蛍光を増加させる可能性があります13,14。 DAPIでスライドを10分間染色します。スライドを2x SSCバッファーで5分間すすぎます。注:スライドを自家蛍光クエンチングキットで処理しない場合、DAPI染色は2分に短縮できます。 スライドを脱イオン水にすばやく1秒以内に浸し、ペーパータオルで余分な水分を吸収してすばやく乾かします。注: これはオプションの手順です。脱イオン水処理は、スライド上のSSCバッファーの塩結晶の堆積を効果的に防止し、イメージング品質を向上させます。しかし、このような低イオン条件下では、FISHプローブと標的DNAとの間の水素結合が弱まり、プローブの解離やシグナル損失につながります。したがって、水処理ステップを非常に短時間維持することが重要です。 スライドを乾燥させ、色あせ防止封入剤でマウントします。イメージングする前に、カバーガラスをマニキュアで密封します。注:スライドを自家蛍光消光試薬で処理する場合は、製造元の指示に従って、スライドに退色防止封入剤を封入してください。さらに、封入剤の種類、硬化性または非硬化性に応じて、サンプルを1〜24時間硬化させてから、シールおよびイメージングする必要があります。イメージングに最適な屈折率を達成するために、サンプルを少なくとも一晩硬化させることをお勧めします。 60×オイルレンズを使用して蛍光シグナルを捕捉します。DAPIチャンネルを使用してフォーカスを調整します。複数のZスタックを取得するようにしてください。通常、1μm間隔で5〜10個のzスタックで十分です。最高の解像度を達成するために、最大の3D投影を実行します。デコンボリューションまたはその他の背景クリアリングアルゴリズムを適用して、画質をさらに向上させます。