Détection robuste de l’amplification génique dans des échantillons fixés au formol et inclus dans de la paraffine par hybridation in situ en fluorescence

Ce protocole de recherche a été approuvé par l’Institutional Review Board (IRB) du Southwestern Medical Center de l’Université du Texas. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les patients avant la chirurgie. 1. Préparation des réactifs et des matériaux Préparez la solution de chlorure de sodium (HCl) 0,2 N dans une hotte en ajoutant lentement 8,212 mL de HCl (37 % p/p ou 12,1 N) à 491,788 mL de ddH2O. Conserver à température ambiante (RT).ATTENTION : Ajouter lentement de l’acide à l’eau. N’ajoutez pas d’eau à l’acide. Préparez une solution d’acide citrique de 10 mM (pH 6,0) en dissolvant 1,47 g de citrate trisodique (dihydraté) dans 400 mL de ddH2O. Utilisez du HCl pour ajuster à pH 6,0, puis portez le volume final à 500 mL avec du ddH2O. Conservez le tampon à RT. Préparez la solution de Tween-20 à 10 % en ajoutant 100 μL de Tween-20 à 900 μL de ddH2O. Conservez-la à RT. Préparez la solution d’IGEPAL à 10 % en ajoutant 5 mL d’IGEPAL CA-630 à 45 mL de ddH2O. Conservez-la à RT. Préparez la solution 20x SSC (pH 7,0, 3 M NaCl, 0,3 M Sodium Citrate) en dissolvant 44,1 g de citrate tri-sodique (dihydraté) et 87,65 g de chlorure de sodium (NaCl) dans 900 mL de ddH 2 O. Utilisez HCl pour ajuster au pH7,0, puis amenez le volume final à 1000 mL avec ddH2O. Conservez le tampon à RT. Préparez la solution 2x SSC en ajoutant 100 mL de 20x SSC à 900 mL de ddH2O. Au besoin, ajouter 0,5 mL de produit de préservation (Table des matières). Stockez-le chez RT. Préparez le tampon d’hybridation de la sonde en mélangeant 910 μL de ddH2O, 500 μL de 20x SSC, 50 μL de 10 % de Tween-20, 40 μL de RNase A, 1 mL de sulfate de dextran à 50 % et 2,5 mL de formamide. Injectez-les dans 1 mL et conservez-les à -20 °C. Préparez la solution 0,4x SSC avec 0,3% IGEPAL en mélangeant 100 mL de 2x SSC, 15 mL d’IGEPAL 10% et 385 mL de ddH2O. Conservez-le à RT. Préparez la solution 2 fois avec 0,1 % d’IGEPAL en ajoutant 5 mL d’IGEPAL à 10 % à 495 mL de solution 2 fois plus d’IGEPAL. Stockez-le chez RT. Préparez fraîchement le tampon de digestion de la protéinase K avant de l’utiliser en ajoutant 1 μL de protéinase K à 99 μL de tampon Tris-EDTA. Préparez un stock de stockage de DAPI de 1 mg/mL en dissolvant 1 mg de DAPI dans 1 mL de ddH2O. Conservez-le à -20 °C et à l’abri de la lumière. Préparez la solution de travail DAPI en ajoutant 1 μL de stock de stockage DAPI à 999 μL de solution SSC 2x. Conserver à l’abri de la lumière jusqu’à l’utilisation. 2. Prétraitement de l’échantillon REMARQUE : La lame utilisée ici contient l’échantillon. Faites vieillir la lame à 60-90 °C pendant 20 minutes ou toute la nuit (Figure 1).REMARQUE : Cette étape facilite la fusion de la paraffine. Habituellement, 20 min de chauffage suffisent. Il peut être prolongé jusqu’à la nuit pour s’adapter à l’horaire. Déparaffiniser la lame en l’immergeant dans du xylène ou ses substituts dans un bocal Coplin pendant 10 min. Répétez cette étape avec du xylène frais ou ses substituts. Effectuez toutes les étapes de prétraitement et de lavage suivantes dans un bocal Coplin.REMARQUE : Les substituts de xylène sont des alternatives sûres et écologiques au xylène. L’un des substituts (voir tableau des matériaux) fonctionne aussi bien que le xylène, sinon mieux. Bien que les substituts de xylène produisent moins d’odeurs que le xylène, il est recommandé de l’utiliser à l’intérieur d’une hotte. Si les substituts de xylène ne sont pas accessibles, toutes les procédures sont compatibles avec la déparaffinisation à base de xylène sans aucune modification. Lavez le substitut de xylène avec de l’éthanol à 100 % pendant 5 min. Réhydratez la lame avec une immersion à 70% d’éthanol pendant 5 min. Immergez la lame dans de l’acide chlorhydrique 0,2 N (HCl) à RT pendant 20 min.REMARQUE : Le HCl extrait efficacement les protéines solubles dans l’acide, telles que les protéines nucléaires basiques, pour améliorer l’accessibilité de l’ADN aux sondes FISH11. Immerger la lame dans 10 mM de solution chaude d’acide citrique et incuber à 90-95 °C pendant 20 min.REMARQUE : Le traitement à l’acide citrique à haute température extrait de la même manière les protéines solubles dans l’acide. On pense que les deux traitements à l’acide extraient les protéines de la matrice extracellulaire pour diminuer l’autofluorescence12. Il est recommandé de préchauffer la solution citrique à la plage de température souhaitée avant d’être appliquée sur la lame. Le micro-ondes peut être un moyen pratique de le faire. Un bain-marie, comme avec un cuiseur sous vide, est la solution la plus efficace et la plus économique pour l’incubation à haute température. Rincez brièvement la lame dans 2x SSC pour neutraliser le pH. Digérez le tissu en ajoutant 100 à 200 μL (suffisamment pour couvrir complètement le tissu selon la taille de la section) de tampon de digestion de la protéinase K et incubez à RT pendant 1 min.REMARQUE : La digestion de la protéinase K augmente encore l’accessibilité des sondes FISH et réduit l’autofluorescence. Le temps de digestion doit être optimisé en fonction des types de tissus. Dans la plupart des cas, 1 minute de digestion suffit. Une surdigestion conduit à une morphologie des noyaux en forme de halo, et le temps de digestion doit être réduit. Arrêtez immédiatement la digestion de la protéinase K et déshydratez la lame en l’immergeant dans de l’éthanol à 70 % pendant 2 min, suivie d’un traitement à 85 % et à 100 % d’éthanol pendant 2 minutes chacune. 3. FISH et imagerie Préparez le mélange d’hybridation FISH en diluant 2 μL de sonde FISH avec 8 μL de tampon d’hybridation, puis appliquez-le sur la lame. Recouvrez l’échantillon d’une lamelle.REMARQUE : Le stock total de sondes FISH utilisé varie de 0,5 à 4 μL, en fonction de la qualité de l’image. Si le signal est trop faible, augmentez l’entrée de la sonde. Réduisez l’entrée de la sonde FISH si le bruit de fond est trop élevé, en particulier lorsque des débris fluorescents sont observés à l’extérieur des noyaux. Le tampon d’hybridation peut être soit celui fourni avec les sondes achetées dans le commerce, soit préparé comme indiqué dans la section 1. Placez les lames sur une plaque chauffante, telle qu’un système d’hybridation des douves de diapositives, pour dénaturer l’ADN à 75 °C pendant 2 à 5 min. Ensuite, transférez la lame sur une autre plaque chauffante réglée à 37 °C pour hybrider pendant la nuit.REMARQUE : Si la plaque chauffante dispose d’un bac à eau ou d’un réservoir pour maintenir l’humidité pendant l’hybridation, il n’est pas nécessaire de sceller la lamelle avec de la colle de caoutchouc. Après l’hybridation, trempez la glissière dans 40-60 °C réchauffé 0,4x SSC avec 0,3% de tampon de lavage IGEPAL CA-630, puis retirez soigneusement la lamelle. Continuez le lavage deux fois pendant 5 minutes chacune dans l’obscurité, en agitant pendant les 10 à 15 premières secondes.REMARQUE : Tremper la glissière dans le tampon de lavage aide à libérer doucement la lamelle. Lavez la lame en SSC avec 0,1% d’IGEPAL CA-630 pendant 5 min à RT dans l’obscurité, avec agitation pendant les 10-15 premières s. Pour éteindre l’autofluorescence, traitez la lame avec le kit de trempe par autofluorescence (voir le tableau des matériaux) en appliquant 150 μL de réactif (50 μL + 50 μL + 50 μL de réactifs A, B, C) pendant 2 à 5 min, puis lavez-la avec 2x SSC pendant 5 min.REMARQUE : Il s’agit d’une étape facultative. L’autofluorescence tissulaire provient principalement de composants de la matrice extracellulaire, tels que le collagène et l’élastine. Il est également significativement influencé par les lysosomes et les mitochondries en raison de leur teneur en lipofuscine, en NADPH et en coenzyme flavine. La fixation de l’aldéhyde et la présence de cellules sanguines peuvent également augmenter l’autofluorescence13,14. Teintez la lame avec du DAPI pendant 10 min. Rincez la lame avec 2x tampon SSC pendant 5 min.REMARQUE : Si la lame n’est pas traitée par le kit de trempe par autofluorescence, la coloration DAPI peut être réduite à 2 min. Trempez rapidement la lame dans de l’eau déminéralisée pendant 1 s maximum, puis séchez-la rapidement en absorbant l’humidité supplémentaire avec une serviette en papier.REMARQUE : Il s’agit d’une étape facultative. Le traitement de l’eau désionisée empêche efficacement le dépôt de cristaux de sel de tampon SSC sur la lame et améliore la qualité de l’imagerie. Cependant, dans de telles conditions de faible ionion, les liaisons hydrogène entre la sonde FISH et l’ADN ciblé sont affaiblies, ce qui entraîne une dissociation de la sonde et une perte de signal. Par conséquent, il est crucial de maintenir l’étape de traitement de l’eau pendant une très courte période. Séchez la diapositive, puis montez-la avec un support de montage anti-évanouissement. Scellez la lamelle avec du vernis à ongles avant l’imagerie.REMARQUE : Si la lame est traitée avec un réactif d’extinction par autofluorescence, montez la lame avec un support de montage anti-décoloration conformément aux instructions du fabricant. De plus, selon le type de support d’enrobage, durcissant ou non durci, l’échantillon doit être durci pendant 1 à 24 h avant le scellement et l’imagerie. Il est recommandé de durcir l’échantillon au moins pendant la nuit pour obtenir le meilleur indice de réfraction pour l’imagerie. Utilisez une lentille à huile de 60 × pour capturer le signal de fluorescence. Utilisez le canal DAPI pour régler la mise au point. Assurez-vous d’obtenir plusieurs piles Z. En règle générale, 5 à 10 piles z avec un intervalle de 1 μm sont suffisantes. Effectuez une projection 3D maximale pour obtenir la meilleure résolution. Appliquez des algorithmes de déconvolution ou d’effacement d’arrière-plan pour améliorer encore la qualité de l’image.