Robuuste detectie van genamplificatie in in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde monsters door fluorescentie in situ hybridisatie
Summary
Dit protocol biedt een reproduceerbare methode om genamplificatie te visualiseren in in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) weefselmonsters.
Abstract
Focale genamplificatie, zoals extrachromosomaal DNA (ecDNA), speelt een belangrijke rol bij de ontwikkeling van kanker en therapieresistentie. Hoewel op sequencing gebaseerde methodologieën een onbevooroordeelde identificatie van ecDNA mogelijk maken, blijven cytogenetische technieken, zoals fluorescentie in situ hybridisatie (FISH), tijd- en kosteneffectief voor het identificeren van ecDNA in klinische monsters. De toepassing van FISH in in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) weefselmonsters biedt een unieke weg voor het detecteren van geamplificeerde genen, vooral wanneer levensvatbare monsters niet beschikbaar zijn voor karyotype-onderzoek. Er is echter een gebrek aan consensusprocedures voor deze techniek. Dit protocol biedt uitgebreide, volledig geoptimaliseerde, stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van FISH om genamplificatie te detecteren, inclusief ecDNA, in FFPE-weefselmonsters die unieke uitdagingen met zich meebrengen die dit protocol wil overwinnen en standaardiseren. Door dit protocol te volgen, kunnen onderzoekers reproduceerbaar beeldvormingsgegevens van hoge kwaliteit verkrijgen om genamplificatie te beoordelen.
Introduction
De studie van focale oncogenamplificatie is cruciaal omdat het de vorming, progressie entherapieresistentie van kanker stimuleert. Belangrijk is dat oncogenen en immunoregulerende genen kunnen amplificeren als extrachromosomale DNA’s (ecDNA), waarvan de asymmetrische overerving genetische heterogeniteit bij kanker bevordert. ecDNA is in verband gebracht met therapieresistentie en ongunstige klinische resultaten 4,5,6.
In formaline gefixeerde paraffine ingebedde (FFPE) weefselmonsters vertegenwoordigen een enorme archiefbron in pathologielaboratoria en bieden overvloedige informatie voor retrospectieve studies. Het extraheren van moleculaire gegevens uit FFPE-monsters door middel van PCR of sequencing is echter een uitdaging vanwege nucleïnezuurfragmentatie, degradatie en verknoping tijdens fixatie7. Van de vele technieken die beschikbaar zijn voor moleculaire analyse van FFPE-weefsels, is fluorescerende in situ hybridisatie (FISH) effectief gebleken voor het visualiseren van specifieke DNA-sequenties8.
Ondanks de vooruitgang van moderne moleculaire diagnostische technieken, biedt het vermogen van FISH om genamplificatie op celniveau te visualiseren en te kwantificeren waardevolle inzichten in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan tumorigenese en klinische resultaten. Door fluorescerend gelabelde sondes te gebruiken die complementair zijn aan het doelgen van belang, kan FISH gemakkelijk de lokalisatie van een oncogen oplossen en de vorm van oncogenamplificatie (zoals ecDNA) binnen individuele cellen afleiden, wat anders onmogelijk of duur is via andere technologieën. Daarom biedt FISH een economische manier om tumorheterogeniteit en klonale evolutie te beoordelen9. Bovendien heeft de vooruitgang op het gebied van automatisering, beeldvorming en computationele analyse high-throughput-analyse van FISH-gegevens mogelijk gemaakt, waardoor robuuste kwantificering van genamplificatie in grote weefselcohorten mogelijkis 10.
Het toepassen van FISH op FFPE-weefsel brengt echter inherente uitdagingen met zich mee, waaronder verknopingsartefacten en autofluorescentie op de achtergrond. Het overwinnen van deze obstakels vereist een zorgvuldige optimalisatie van elke procedure om nauwkeurige en reproduceerbare resultaten te garanderen. Dit artikel biedt een stapsgewijs, volledig geoptimaliseerd protocol voor het toepassen van FISH om genamplificatie in FFPE-weefselmonsters te onderzoeken. Met behulp van een sonde gericht op de ERBB2 (HER2) genlocus, tonen we aan dat FISH de ERBB2-amplificatiestatus robuust kan detecteren in FFPE-monsters van borstkankerpatiënten. Het is zelfs mogelijk om in te schatten of ERBB2 wordt geamplificeerd als ecDNA’s. Door bestaande literatuur en onze experimentele bevindingen te synthetiseren, verhelderen we de methodologische overwegingen, technische uitdagingen en mogelijke valkuilen van op FISH gebaseerde analyse. We bespreken ook de klinische relevantie van genamplificatieprofilering bij verschillende soorten kanker, waarbij we de prognostische betekenis en het potentieel voor gepersonaliseerde therapeutische strategieën benadrukken.
Samenvattend onderstreept dit artikel het belang van FISH als een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van genamplificatie in FFPE-weefselmonsters, en biedt het ongeëvenaarde inzichten in tumorbiologie en begeleidt het de klinische besluitvorming in de oncologie. Met voortdurende verfijning en integratie met complementaire moleculaire assays, staat FISH-gebaseerde analyse klaar om ons begrip van de pathogenese van kanker verder te vergroten en de patiëntresultaten te verbeteren in het tijdperk van precisiegeneeskunde.
Protocol
Representative Results
Discussion
FISH is een snelle en betaalbare optie voor cytogenetische diagnose. Vooral bij het bepalen of ecDNA aanwezig is bij kanker, blijft FISH-bewijs de gouden standaard1. FISH in FFPE-weefsel maakt een snelle bepaling van de genstatus in de biopsiemonsters van een patiënt mogelijk, waardoor een snellere diagnose kan worden gesteld en veranderingen tijdens de voortgang van de ziekte kunnen worden gevolgd. Deze techniek is vooral waardevol voor het testen van klinische monsters die al zijn verzameld voor pathologie.
Dit protocol omvat verschillende kritieke stappen. De eerste stap is een grondige deparaffinisatie. Resterende paraffine kan de hybridisatie van FISH verstoren. Als het monster er na stap 2 nog steeds wasachtig uitziet, moet het opnieuw worden behandeld met vers xyleen of zijn vervangers.
Ten tweede zijn eiwitextractie en -vertering van cruciaal belang. Deze processen verbeteren niet alleen de toegankelijkheid van het DNA tot de FISH-sonde, maar verminderen ook de autofluorescentie aanzienlijk. Dit protocol omvat drie deproteinisatiestappen. Hoewel de behandeling met 0,2 N HCl en 10 mM citroenzuur eenvoudig is, kan de proteïnase K-vertering geoptimaliseerd moeten worden. Oververtering is de meest voorkomende fout bij het gebruik van proteïnase K, wat resulteert in halo-vormige kernen. Het verkorten van de verteringstijd zal de morfologie van de kernen verbeteren. Bovendien wordt aanbevolen om niet meer dan vier monsters tegelijk te verteren om het tijdsverschil tussen het eerste en het laatste monster te minimaliseren. Het is belangrijk op te merken dat zelfs een intacte kern er bij hoge vergroting en hogeresolutiemicroscopie uit kan zien als een halo. Dit komt omdat de kern zich niet op hetzelfde brandpuntsvlak bevindt. Daarom wordt voorgesteld om meerdere Z-stacks te nemen en een maximale projectie uit te voeren om de nucleaire morfologie te inspecteren.
Ten slotte wordt het blussen van autofluorescentie aanbevolen. Hoewel zuurextractie en proteïnase K-vertering de eiwitafgeleide achtergrond aanzienlijk kunnen verminderen, kunnen fluorescerende metabolieten nog steeds de beeldvormingskwaliteit beïnvloeden.
Hoewel FISH een ongeëvenaarde ruimtelijke resolutie biedt bij het identificeren van focale genamplificatie, heeft het beperkingen. Ten eerste zijn de inhoud en doorvoer laag in vergelijking met op PCR of next-generation sequencing (NGS) gebaseerde benaderingen. Doorgaans kunnen één tot drie FISH-sondes van verschillende kleuren op een enkel objectglaasje worden aangebracht zonder gespecialiseerde apparatuur. Desalniettemin heeft de vooruitgang in automatiseringstechnologieën FISH met een hoge inhoud en een hoge doorvoer, zoals in situ sequencing21, haalbaar gemaakt. Ten tweede vereist het ontwerp van de FISH-sonde voorafgaande informatie. De voortdurende inspanningen om terugkerende focale amplificatiegebeurtenissen bij kanker te identificeren, hebben de creatie van vooraf ontworpen FISH-panelen voor laboratorium- en klinische toepassingen mogelijk gemaakt. Oncogenen uit de MYC-familie worden bijvoorbeeld vaak geamplificeerd als ecDNA bij kleincellige longkanker om resistentie tegen chemotherapie te mediëren. Daarom kan een FISH-panel gericht op MYC-, MYCL- en MYCN-genen de bepaling van behandelingsreacties in biopsieën versnellen. Ter vergelijking: NGS maakt een meer onbevooroordeelde screening van interessante genen mogelijk. Van de op NGS gebaseerde technologieën kan echter alleen sequencing van het hele genoom met rekendure analyse22 ecDNA karakteriseren.
Samenvattend presenteren we robuuste en uitgebreide instructies voor het onderzoeken van focale genamplificatie in FFPE-monsters. Door het FISH-signaalpatroon te onderzoeken, wordt ondubbelzinnig duidelijk of en hoe een genlocus wordt versterkt. We verwachten de integratie van machine learning in de beeldanalyse23 van interfasekernen om cytogenetische informatie te extraheren met betrekking tot het aantal kopieën en de vorm van amplificatie (chromosoom of ecDNA), waardoor het moleculaire diagnoseproces wordt gestroomlijnd en ons begrip van pathogenetische mechanismen bij kanker wordt verbeterd.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.W. is een geleerde van en wordt ondersteund door het Cancer Prevention and Research Institute of Texas (RR210034)
Materials
| DAPI | Tocris Bioscience | 5748 | Nucleus staining |
| Dextran sulfate 50% solution | EMD Millipore Sigma | S4030 | Probe hybridization buffer |
| ERBB2 (HER2) FISH Probe | Empire Genomics | ERBB2-20-RE | FISH probe |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | Dehydrating and hydrating tissue |
| Formamide | Thermo Scientific Chemicals | 205821000 | Probe hybridization buffer |
| Formula 83 (Xylene substitute) | CBG Biotech | CH0104A | Removing paraffin |
| Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | Sample pretreatment |
| IGEPAL CA-630 | Thermo Scientific Chemicals | J19628K2 | Slide washing |
| Proclin 300 | Sigma-Aldrich | 48914-U | Preservative for SSC buffer (optional) |
| Proteinase K (800 units/mL) | New England Biolabs | P8107S | Protein digestion |
| RNase A (20 mg/mL) | New England Biolabs | T3018L | Probe hybridization buffer |
| Slide Moat Hybridization System | Boekel Scientific | 280001 | Sample denature and hybridization. Alternative hot plates are acceptable. |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S2713 | SSC buffer |
| Sodium citrate dihydrate | Fisher BioReagents | FLBP3271 | SSC buffer and sample pretreatment |
| Tris-EDTA (TE) buffer | Fisher BioReagents | BP2473500 | Proteinase K digestion buffer |
| Tween-20 | Fisher BioReagents | BP337-500 | Probe hybridization buffer |
| Vectashield antifade mounting media | Vector Laboratories | H190010 | Slide mounting |
| Vector TrueVIEW | Vector Laboratories | SP8400 | Autofluorescence quenching kit |
References
- ICGC/TCGA Pan-Cancer Analysis of Whole Genomes Consortium. Pan-cancer analysis of whole genomes. Nature. 578 (7793), 82-93 (2020).
- Wu, S., Bafna, V., Chang, H. Y., Mischel, P. S. Extrachromosomal DNA: An emerging hallmark in human cancer. Annu Rev Pathol. 17, 367-386 (2022).
- Luebeck, J., et al. Extrachromosomal DNA in the cancerous transformation of Barrett’s oesophagus. Nature. 616 (7958), 798-805 (2023).
- Nathanson, D. A., et al. Targeted therapy resistance mediated by dynamic regulation of extrachromosomal mutant EGFR DNA. Science. 343 (6166), 72-76 (2014).
- Kim, H., et al. Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers. Nat Genet. 52 (9), 891-897 (2020).
- Pal Choudhuri, S., et al. Acquired cross-resistance in small cell lung cancer due to extrachromosomal DNA amplification of MYC paralogs. Cancer Discov. 14 (5), 804-827 (2024).
- Greytak, S. R., Engel, K. B., Bass, B. P., Moore, H. M. Accuracy of molecular data generated with FFPE biospecimens: Lessons from the literature. Cancer Res. 75 (8), 1541-1547 (2015).
- Chrzanowska, N. M., Kowalewski, J., Lewandowska, M. A. Use of fluorescence in situ hybridization (FISH) in diagnosis and tailored therapies in solid tumors. Molecules. 25 (8), 1864 (2020).
- Cui, C., Shu, W., Li, P. Fluorescence in situ hybridization: Cell-based genetic diagnostic and research applications. Front Cell Dev Biol. 4, 89 (2016).
- Finn, E. H., Misteli, T. A high-throughput DNA FISH protocol to visualize genome regions in human cells. STAR Protoc. 2 (3), 100741 (2021).
- Watters, A. D., Bartlett, J. M. S. Fluorescence in situ hybridization in paraffin tissue sections. Mol Biotechnol. 21 (3), 217-220 (2002).
- Richardson, S. O., et al. One-fits-all pretreatment protocol facilitating fluorescence in situ hybridization on formalin-fixed paraffin-embedded, fresh frozen and cytological slides. Mol Cytogenet. 12, 27 (2019).
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnol Annu Rev. 11, 227-256 (2005).
- Davis, A. S., et al. Characterizing and diminishing autofluorescence in formalin-fixed paraffin-embedded human respiratory tissue. J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).
- Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
- Liang, Z., et al. Chromatin-associated RNA dictates the ecDNA interactome in the nucleus. bioRxiv. , (2023).
- Lange, J. T., et al. The evolutionary dynamics of extrachromosomal DNA in human cancers. Nat Genet. 54 (10), 1527-1533 (2022).
- Hung, K. L., et al. ecDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression. Nature. 600 (7890), 731-736 (2021).
- Storlazzi, C. T., et al. Gene amplification as double minutes or homogeneously staining regions in solid tumors: origin and structure. Genome Res. 20 (9), 1198-1206 (2010).
- Guerin, T. M., Marcand, S. Breakage in breakage-fusion-bridge cycle: an 80-year-old mystery. Trends Genet. 38 (7), 641-645 (2022).
- Nguyen, H. Q., et al. 3D mapping and accelerated super-resolution imaging of the human genome using in situ sequencing. Nat Methods. 17 (8), 822-832 (2020).
- Deshpande, V., et al. Exploring the landscape of focal amplifications in cancer using AmpliconArchitect. Nat Commun. 10 (1), 392 (2019).
- Rajkumar, U., et al. EcSeg: Semantic segmentation of metaphase images containing extrachromosomal DNA. iScience. 21, 428-435 (2019).
.