Questo protocollo fornisce un metodo riproducibile per visualizzare l’amplificazione genica in campioni di tessuto inclusi in paraffina (FFPE) fissati in formalina.
L’amplificazione genica focale, come il DNA extracromosomico (ecDNA), svolge un ruolo importante nello sviluppo del cancro e nella resistenza alla terapia. Mentre le metodologie basate sul sequenziamento consentono un’identificazione imparziale dell’ecDNA, le tecniche basate sulla citogenetica, come l’ibridazione in situ a fluorescenza (FISH), rimangono efficienti in termini di tempo e costi per l’identificazione dell’ecDNA nei campioni clinici. L’applicazione della FISH in campioni di tessuto inclusi in formalina fissata in paraffina (FFPE) offre una via unica per rilevare geni amplificati, in particolare quando non sono disponibili campioni vitali per l’esame del cariotipo. Tuttavia, mancano procedure di consenso per questa tecnica. Questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate, complete e completamente ottimizzate per l’esecuzione di FISH per rilevare l’amplificazione genica, incluso l’ecDNA, in campioni di tessuto FFPE che presentano sfide uniche che questo protocollo mira a superare e standardizzare. Seguendo questo protocollo, i ricercatori possono acquisire in modo riproducibile dati di imaging di alta qualità per valutare l’amplificazione genica.
Lo studio dell’amplificazione focale dell’oncogene è fondamentale in quanto guida la formazione, la progressione e la resistenza alla terapiadel cancro 1. È importante sottolineare che gli oncogeni e i geni immunoregolatori possono amplificarsi come DNA extracromosomici (ecDNA), la cui eredità asimmetrica promuove l’eterogeneità genetica nel cancro 2,3. L’ecDNA è stato collegato alla resistenza alla terapia e agli esiti clinici sfavorevoli 4,5,6.
I campioni di tessuto FFPE (FFPE) fissati in formalina rappresentano una vasta risorsa archivistica nei laboratori di patologia, offrendo informazioni abbondanti per studi retrospettivi. Tuttavia, l’estrazione di dati molecolari da campioni FFPE attraverso la PCR o il sequenziamento è difficile a causa della frammentazione, della degradazione e della reticolazione degli acidi nucleici durante la fissazione7. Tra le tecniche disponibili per l’analisi molecolare dei tessuti FFPE, l’ibridazione fluorescente in situ (FISH) si è dimostrata efficace per la visualizzazione di specifiche sequenze di DNA8.
Nonostante il progresso delle moderne tecniche diagnostiche molecolari, la capacità della FISH di visualizzare e quantificare l’amplificazione genica a livello di singola cellula fornisce preziose informazioni sui meccanismi molecolari alla base della tumorigenesi e sugli esiti clinici. Utilizzando sonde marcate in fluorescenza complementari al gene bersaglio di interesse, FISH può risolvere convenientemente la localizzazione di un oncogene e può dedurre la forma di amplificazione dell’oncogene (come l’ecDNA) all’interno delle singole cellule, cosa altrimenti impossibile o costosa con altre tecnologie. Pertanto, la FISH offre un modo economico per valutare l’eterogeneità del tumore e l’evoluzione clonale9. Inoltre, i progressi nell’automazione, nell’imaging e nell’analisi computazionale hanno facilitato l’analisi ad alto rendimento dei dati FISH, consentendo una solida quantificazione dell’amplificazione genica in grandi coorti di tessuti10.
Tuttavia, l’applicazione di FISH al tessuto FFPE presenta sfide intrinseche, tra cui artefatti di reticolazione e autofluorescenza di fondo. Il superamento di questi ostacoli richiede un’attenta ottimizzazione di ogni procedura per garantire risultati accurati e riproducibili. Questo articolo fornisce un protocollo passo-passo e completamente ottimizzato per l’applicazione della FISH per studiare l’amplificazione genica nei campioni di tessuto FFPE. Utilizzando una sonda che ha come bersaglio il locus del gene ERBB2 (HER2), dimostriamo che la FISH è in grado di rilevare in modo robusto lo stato di amplificazione di ERBB2 nei campioni di FFPE di pazienti con carcinoma mammario. È anche possibile stimare se ERBB2 è amplificato come ecDNA. Sintetizzando la letteratura esistente e i nostri risultati sperimentali, chiariamo le considerazioni metodologiche, le sfide tecniche e le potenziali insidie dell’analisi basata sulla FISH. Discutiamo anche la rilevanza clinica del profilo di amplificazione genica in vari tipi di cancro, evidenziandone il significato prognostico e il potenziale per strategie terapeutiche personalizzate.
In sintesi, questo articolo sottolinea l’importanza della FISH come strumento prezioso per lo studio dell’amplificazione genica in campioni di tessuto FFPE, offrendo intuizioni senza precedenti sulla biologia dei tumori e guidando il processo decisionale clinico in oncologia. Grazie al continuo perfezionamento e all’integrazione con saggi molecolari complementari, l’analisi basata sulla FISH è pronta a migliorare ulteriormente la nostra comprensione della patogenesi del cancro e a migliorare gli esiti dei pazienti nell’era della medicina di precisione.
La FISH è un’opzione rapida ed economica per la diagnosi citogenetica. Soprattutto nel determinare se l’ecDNA è presente nel cancro, l’evidenza FISH rimane il gold standard1. La FISH nel tessuto FFPE consente una rapida determinazione dello stato genico nei campioni bioptici di un paziente, consentendo una diagnosi più rapida e il monitoraggio dei cambiamenti durante il progresso della malattia. Questa tecnica è particolarmente utile per testare campioni clinici che sono già stati raccolti per la patologia.
Questo protocollo prevede diversi passaggi critici. Il primo passo è la deparaffinazione completa. La paraffina residua può interrompere l’ibridazione della FISH. Se il campione appare ancora ceroso dopo il passaggio 2, deve essere trattato nuovamente con xilene fresco o suoi sostituti.
In secondo luogo, l’estrazione e la digestione delle proteine sono fondamentali. Questi processi non solo migliorano l’accessibilità del DNA alla sonda FISH, ma riducono anche significativamente l’autofluorescenza. Questo protocollo include tre fasi di deproteinizzazione. Mentre il trattamento con 0,2 N di HCl e 10 mM di acido citrico è semplice, la digestione della proteinasi K può richiedere un’ottimizzazione. La sovradigestione è l’errore più comune quando si utilizza la proteinasi K, con conseguente nuclei a forma di alone. Accorciare il tempo di digestione migliorerà la morfologia dei nuclei. Inoltre, si raccomanda di non digerire più di quattro campioni contemporaneamente per ridurre al minimo la differenza di tempo tra il primo e l’ultimo campione. È importante notare che anche un nucleo intatto può apparire come un alone al microscopio ad alto ingrandimento e ad alta risoluzione. Questo perché il nucleo non si trova sullo stesso piano focale. Pertanto, si suggerisce di prendere più Z-stack ed eseguire una proiezione massima per ispezionare la morfologia nucleare.
Infine, si consiglia l’autofluorescenza estinta. Sebbene l’estrazione acida e la digestione della proteinasi K possano ridurre significativamente il background di origine proteica, i metaboliti fluorescenti possono comunque influenzare la qualità dell’imaging.
Sebbene la FISH offra una risoluzione spaziale senza precedenti nell’identificazione dell’amplificazione genica focale, presenta dei limiti. In primo luogo, il contenuto e la produttività sono bassi rispetto agli approcci basati sulla PCR o sul sequenziamento di nuova generazione (NGS). In genere, da una a tre sonde FISH di colori diversi possono essere applicate a un singolo vetrino senza attrezzature specializzate. Ciononostante, i progressi nelle tecnologie di automazione hanno reso fattibile la FISH ad alto contenuto e ad alto rendimento, come il sequenziamento in situ 21. In secondo luogo, il progetto della sonda FISH richiede informazioni preliminari. Gli sforzi in corso per identificare gli eventi di amplificazione focale ricorrenti nel cancro hanno permesso la creazione di pannelli FISH pre-progettati per applicazioni di laboratorio e cliniche. Ad esempio, gli oncogeni della famiglia MYC sono spesso amplificati come ecDNA nel carcinoma polmonare a piccole cellule per mediare la resistenza alla chemioterapia. Pertanto, un pannello FISH mirato ai geni MYC, MYCL e MYCN può accelerare la determinazione delle risposte al trattamento nelle biopsie. In confronto, l’NGS consente uno screening più imparziale dei geni di interesse. Tuttavia, tra le tecnologie basate su NGS, solo il sequenziamento dell’intero genoma con analisi computazionale22 può caratterizzare l’ecDNA.
In sintesi, presentiamo istruzioni solide e complete per studiare l’amplificazione genica focale nei campioni FFPE. Esaminando il modello di segnale FISH, diventa inequivocabilmente chiaro se e come un locus genico viene amplificato. Prevediamo l’integrazione dell’apprendimento automatico nell’analisi delle immagini23 dei nuclei interfasici per estrarre informazioni citogenetiche riguardanti il numero di copie e la forma di amplificazione (cromosoma o ecDNA), semplificando così il processo di diagnosi molecolare e migliorando la nostra comprensione dei meccanismi patogenetici nel cancro.
The authors have nothing to disclose.
S.W. è uno studioso ed è supportato dal Cancer Prevention and Research Institute of Texas (RR210034)
DAPI | Tocris Bioscience | 5748 | Nucleus staining |
Dextran sulfate 50% solution | EMD Millipore Sigma | S4030 | Probe hybridization buffer |
ERBB2 (HER2) FISH Probe | Empire Genomics | ERBB2-20-RE | FISH probe |
Ethanol | Decon Labs | 2716 | Dehydrating and hydrating tissue |
Formamide | Thermo Scientific Chemicals | 205821000 | Probe hybridization buffer |
Formula 83 (Xylene substitute) | CBG Biotech | CH0104A | Removing paraffin |
Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | Sample pretreatment |
IGEPAL CA-630 | Thermo Scientific Chemicals | J19628K2 | Slide washing |
Proclin 300 | Sigma-Aldrich | 48914-U | Preservative for SSC buffer (optional) |
Proteinase K (800 units/mL) | New England Biolabs | P8107S | Protein digestion |
RNase A (20 mg/mL) | New England Biolabs | T3018L | Probe hybridization buffer |
Slide Moat Hybridization System | Boekel Scientific | 280001 | Sample denature and hybridization. Alternative hot plates are acceptable. |
Sodium chloride | Fisher Chemical | S2713 | SSC buffer |
Sodium citrate dihydrate | Fisher BioReagents | FLBP3271 | SSC buffer and sample pretreatment |
Tris-EDTA (TE) buffer | Fisher BioReagents | BP2473500 | Proteinase K digestion buffer |
Tween-20 | Fisher BioReagents | BP337-500 | Probe hybridization buffer |
Vectashield antifade mounting media | Vector Laboratories | H190010 | Slide mounting |
Vector TrueVIEW | Vector Laboratories | SP8400 | Autofluorescence quenching kit |
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