Este protocolo fornece um método reprodutível para visualizar a amplificação gênica em amostras de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE).
A amplificação focal de genes, como o DNA extracromossômico (ecDNA), desempenha um papel importante no desenvolvimento do câncer e na resistência à terapia. Embora as metodologias baseadas em sequenciamento permitam uma identificação imparcial do ecDNA, as técnicas baseadas em citogenética, como a hibridização in situ fluorescente (FISH), permanecem econômicas e de tempo para identificar o ecDNA em amostras clínicas. A aplicação de FISH em amostras de tecido embebidas em parafina fixadas em formalina (FFPE) oferece um caminho único para detectar genes amplificados, particularmente quando amostras viáveis não estão disponíveis para exame de cariótipo. No entanto, faltam procedimentos de consenso para essa técnica. Este protocolo fornece instruções passo a passo abrangentes, totalmente otimizadas para a realização de FISH para detectar amplificação gênica, incluindo ecDNA, em amostras de tecido FFPE que apresentam desafios únicos que este protocolo visa superar e padronizar. Seguindo este protocolo, os pesquisadores podem adquirir de forma reprodutível dados de imagem de alta qualidade para avaliar a amplificação gênica.
O estudo da amplificação de oncogenes focais é crucial, pois impulsiona a formação, progressão e resistência à terapiado câncer 1. É importante ressaltar que oncogenes e genes imunorreguladores podem se amplificar como DNAs extracromossômicos (ecDNA), cuja herança assimétrica promove heterogeneidade genética no câncer 2,3. O ecDNA tem sido associado à resistência à terapia e a resultados clínicos desfavoráveis 4,5,6.
Amostras de tecido fixadas em formalina e embebidas em parafina (FFPE) representam um vasto recurso de arquivo em laboratórios de patologia, oferecendo informações abundantes para estudos retrospectivos. No entanto, a extração de dados moleculares de amostras FFPE por meio de PCR ou sequenciamento é um desafio devido à fragmentação, degradação e reticulação de ácidos nucleicos durante a fixação7. Entre a variedade de técnicas disponíveis para análise molecular de tecidos FFPE, a hibridização in situ fluorescente (FISH) provou ser eficaz na visualização de sequências específicas de DNA8.
Apesar do avanço das técnicas modernas de diagnóstico molecular, a capacidade do FISH de visualizar e quantificar a amplificação gênica no nível de uma única célula fornece informações valiosas sobre os mecanismos moleculares subjacentes à tumorigênese e aos resultados clínicos. Ao usar sondas marcadas com fluorescência complementares ao gene alvo de interesse, o FISH pode resolver convenientemente a localização de um oncogene e pode inferir a forma de amplificação do oncogene (como o ecDNA) dentro de células individuais, o que de outra forma seria impossível ou caro por meio de outras tecnologias. Portanto, o FISH oferece uma maneira econômica de avaliar a heterogeneidade do tumor e a evolução clonal9. Além disso, os avanços na automação, imagem e análise computacional facilitaram a análise de alto rendimento dos dados FISH, permitindo a quantificação robusta da amplificação gênica em grandes coortes de tecidos10.
No entanto, a aplicação de FISH ao tecido FFPE apresenta desafios inerentes, incluindo artefatos de reticulação e autofluorescência de fundo. A superação desses obstáculos requer uma otimização cuidadosa de cada procedimento para garantir resultados precisos e reprodutíveis. Este artigo fornece um protocolo passo a passo totalmente otimizado para a aplicação de FISH para investigar a amplificação gênica em amostras de tecido FFPE. Usando uma sonda direcionada ao locus do gene ERBB2 (HER2), demonstramos que o FISH pode detectar de forma robusta o status de amplificação de ERBB2 em amostras FFPE de pacientes com câncer de mama. É até possível estimar se o ERBB2 é amplificado como ecDNAs. Ao sintetizar a literatura existente e nossas descobertas experimentais, elucidamos as considerações metodológicas, os desafios técnicos e as possíveis armadilhas da análise baseada em FISH. Também discutimos a relevância clínica do perfil de amplificação gênica em vários tipos de câncer, destacando seu significado prognóstico e potencial para estratégias terapêuticas personalizadas.
Em resumo, este artigo ressalta a importância do FISH como uma ferramenta valiosa para estudar a amplificação gênica em amostras de tecido FFPE, oferecendo insights incomparáveis sobre a biologia do tumor e orientando a tomada de decisões clínicas em oncologia. Com refinamento e integração contínuos com ensaios moleculares complementares, a análise baseada em FISH está pronta para aprimorar ainda mais nossa compreensão da patogênese do câncer e melhorar os resultados dos pacientes na era da medicina de precisão.
A FISH é uma opção rápida e acessível para o diagnóstico citogenético. Especialmente para determinar se o ecDNA está presente no câncer, a evidência de FISH continua sendo o padrão-ouro1. O FISH no tecido FFPE permite a determinação rápida do status do gene nas amostras de biópsia de um paciente, permitindo um diagnóstico mais rápido e rastreando as alterações ao longo do progresso da doença. Esta técnica é particularmente valiosa para testar amostras clínicas que já foram coletadas para patologia.
Este protocolo envolve várias etapas críticas. O primeiro passo é a desparafinização completa. A parafina residual pode interromper a hibridização de FISH. Se a amostra ainda parecer cerosa após a etapa 2, ela deve ser tratada novamente com xileno fresco ou seus substitutos.
Em segundo lugar, a extração e a digestão de proteínas são críticas. Esses processos não apenas aumentam a acessibilidade do DNA à sonda FISH, mas também reduzem significativamente a autofluorescência. Este protocolo inclui três etapas de desproteinização. Embora o tratamento com HCl 0,2 N e ácido cítrico 10 mM seja simples, a digestão da proteinase K pode exigir otimização. A digestão excessiva é o erro mais comum ao usar a proteinase K, resultando em núcleos em forma de halo. Encurtar o tempo de digestão melhorará a morfologia dos núcleos. Além disso, recomenda-se não digerir mais de quatro amostras simultaneamente para minimizar a diferença de tempo entre a primeira e a última amostra. É importante notar que mesmo um núcleo intacto pode aparecer como um halo sob microscopia de alta ampliação e alta resolução. Isso ocorre porque o núcleo não está no mesmo plano focal. Portanto, sugere-se pegar várias pilhas Z e realizar uma projeção máxima para inspecionar a morfologia nuclear.
Por fim, recomenda-se a autofluorescência de têmpera. Embora a extração ácida e a digestão da proteinase K possam reduzir significativamente o fundo derivado de proteínas, os metabólitos fluorescentes ainda podem afetar a qualidade da imagem.
Embora o FISH ofereça resolução espacial incomparável na identificação da amplificação focal de genes, ele tem limitações. Primeiro, o conteúdo e o rendimento são baixos em comparação com as abordagens baseadas em PCR ou sequenciamento de próxima geração (NGS). Normalmente, uma a três sondas FISH de cores diferentes podem ser aplicadas a uma única lâmina sem equipamento especializado. No entanto, os avanços nas tecnologias de automação tornaram viável o FISH de alto conteúdo e alto rendimento, como o sequenciamento in situ 21. Em segundo lugar, o projeto da sonda FISH requer informações prévias. Os esforços contínuos para identificar eventos recorrentes de amplificação focal no câncer permitiram a criação de painéis FISH pré-projetados para aplicações laboratoriais e clínicas. Por exemplo, os oncogenes da família MYC são frequentemente amplificados como ecDNA no câncer de pulmão de pequenas células para mediar a resistência à quimioterapia. Portanto, um painel FISH direcionado aos genes MYC, MYCL e MYCN pode acelerar a determinação das respostas ao tratamento em biópsias. Em comparação, o NGS permite uma triagem mais imparcial dos genes de interesse. No entanto, entre as tecnologias baseadas em NGS, apenas o sequenciamento do genoma completo com análise computacional cara22 pode caracterizar o ecDNA.
Em resumo, apresentamos instruções robustas e abrangentes para investigar a amplificação de genes focais em amostras FFPE. Ao examinar o padrão de sinal FISH, torna-se inequivocamente claro se e como um locus gênico é amplificado. Prevemos a integração do aprendizado de máquina na análise de imagens23 de núcleos interfásicos para extrair informações citogenéticas sobre o número de cópias e a forma de amplificação (cromossomo ou ecDNA), simplificando assim o processo de diagnóstico molecular e aprimorando nossa compreensão dos mecanismos patogenéticos no câncer.
The authors have nothing to disclose.
SW é um estudioso e é apoiado pelo Instituto de Pesquisa e Prevenção do Câncer do Texas (RR210034)
DAPI | Tocris Bioscience | 5748 | Nucleus staining |
Dextran sulfate 50% solution | EMD Millipore Sigma | S4030 | Probe hybridization buffer |
ERBB2 (HER2) FISH Probe | Empire Genomics | ERBB2-20-RE | FISH probe |
Ethanol | Decon Labs | 2716 | Dehydrating and hydrating tissue |
Formamide | Thermo Scientific Chemicals | 205821000 | Probe hybridization buffer |
Formula 83 (Xylene substitute) | CBG Biotech | CH0104A | Removing paraffin |
Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | Sample pretreatment |
IGEPAL CA-630 | Thermo Scientific Chemicals | J19628K2 | Slide washing |
Proclin 300 | Sigma-Aldrich | 48914-U | Preservative for SSC buffer (optional) |
Proteinase K (800 units/mL) | New England Biolabs | P8107S | Protein digestion |
RNase A (20 mg/mL) | New England Biolabs | T3018L | Probe hybridization buffer |
Slide Moat Hybridization System | Boekel Scientific | 280001 | Sample denature and hybridization. Alternative hot plates are acceptable. |
Sodium chloride | Fisher Chemical | S2713 | SSC buffer |
Sodium citrate dihydrate | Fisher BioReagents | FLBP3271 | SSC buffer and sample pretreatment |
Tris-EDTA (TE) buffer | Fisher BioReagents | BP2473500 | Proteinase K digestion buffer |
Tween-20 | Fisher BioReagents | BP337-500 | Probe hybridization buffer |
Vectashield antifade mounting media | Vector Laboratories | H190010 | Slide mounting |
Vector TrueVIEW | Vector Laboratories | SP8400 | Autofluorescence quenching kit |
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