Detecção robusta de amplificação gênica em amostras embebidas em parafina fixadas em formalina por hibridização in situ por fluorescência

Este protocolo de pesquisa foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) do Centro Médico do Sudoeste da Universidade do Texas. O consentimento informado foi obtido de todos os pacientes antes da cirurgia. 1. Preparação de reagentes e materiais Preparar a solução de cloreto de sódio (HCl) 0,2 N numa hotte adicionando lentamente 8,212 ml de HCl (37% p/p ou 12,1 N) a 491,788 ml de ddH2O. Conservar à temperatura ambiente (RT).CUIDADO: Adicione ácido lentamente à água. Não adicione água ao ácido. Prepare a solução de ácido cítrico 10 mM (pH 6,0) dissolvendo 1,47 g de citrato trissódico (di-hidratado) em 400 mL de ddH2O. Use HCl para ajustar para pH 6,0 e, em seguida, aumente o volume final para 500 mL com ddH2O. Armazene o tampão em RT. Prepare a solução de Tween-20 a 10% adicionando 100 μL de Tween-20 a 900 μL de ddH2O. Armazene-o em RT. Prepare a solução de IGEPAL a 10% adicionando 5 mL de IGEPAL CA-630 a 45 mL de ddH2O. Armazene-o em RT. Prepare a solução 20x SSC (pH 7,0, 3 M NaCl, 0,3 M Citrato de Sódio) dissolvendo 44,1 g de citrato trissódico (di-hidratado) e 87,65 g de cloreto de sódio (NaCl) em 900 mL de ddH2O. Use HCl para ajustar para pH 7,0 e, em seguida, leve o volume final para 1000 mL com ddH2O. Armazene o tampão em RT. Prepare a solução 2x SSC adicionando 100 mL de 20x SSC a 900 mL de ddH2O. Se necessário, adicione 0,5 mL de conservante (Tabela de Materiais). Armazene-o no RT. Prepare o tampão de hibridização da sonda misturando 910 μL de ddH2O, 500 μL de 20x SSC, 50 μL de 10% Tween-20, 40 μL de RNase A, 1 mL de sulfato de dextrano a 50% e 2,5 mL de formamida. Alíquota em 1 mL e armazene-os a -20 °C. Prepare o SSC 0,4x com solução IGEPAL a 0,3% misturando 100 mL de 2x SSC, 15 mL de IGEPAL a 10% e 385 mL de ddH2O. Armazene-o em RT. Prepare o 2x SSC com solução de IGEPAL a 0,1% adicionando 5 mL de IGEPAL a 10% a 495 mL de solução 2x SSC. Armazene-o no RT. Prepare o tampão de digestão da proteinase K antes de usar, adicionando 1 μL de proteinase K a 99 μL de tampão Tris-EDTA. Prepare 1 mg/mL de DAPI dissolvendo 1 mg de DAPI em 1 mL de ddH2O. Armazene-o a -20 °C e longe da luz. Prepare a solução de trabalho DAPI adicionando 1 μL do estoque de armazenamento DAPI a 999 μL de solução 2x SSC. Mantenha longe da luz até o uso. 2. Pré-tratamento da amostra NOTA: O slide usado aqui contém a amostra. Envelheça o slide a 60-90 ° C por 20 min ou durante a noite (Figura 1).NOTA: Esta etapa facilita o derretimento da parafina. Normalmente, 20 minutos de aquecimento são suficientes. Pode ser estendido para durante a noite para acomodar a programação. Desparafinize a lâmina mergulhando-a em xileno ou seus substitutos em um frasco de Coplin por 10 min. Repita esta etapa com xileno fresco ou seus substitutos. Execute todas as etapas de pré-tratamento e lavagem a seguir em um frasco Coplin.NOTA: Os substitutos do xileno são alternativas seguras e ecológicas ao xileno. Um dos substitutos (ver Tabela de Materiais) tem um desempenho tão bom quanto o xileno, se não melhor. Embora os substitutos do xileno produzam menos odor do que o xileno, recomenda-se usá-lo dentro de uma capela de exaustão. Se os substitutos do xileno não estiverem acessíveis, todos os procedimentos são compatíveis com a desparafinização à base de xileno sem nenhuma alteração. Lave o substituto de xileno com etanol 100% por 5 min. Reidrate a lâmina com imersão em etanol a 70% por 5 min. Mergulhe a lâmina em ácido clorídrico (HCl) 0,2 N em RT por 20 min.NOTA: O HCl extrai efetivamente proteínas solúveis em ácido, como proteínas nucleares básicas, para melhorar a acessibilidade do DNA às sondas FISH11. Mergulhe a lâmina em 10 mM de solução quente de ácido cítrico e incube a 90-95 °C por 20 min.NOTA: O tratamento com ácido cítrico sob altas temperaturas extrai de forma semelhante as proteínas solúveis em ácido. Acredita-se que ambos os tratamentos ácidos extraiam proteínas da matriz extracelular para diminuir a autofluorescência12. Recomenda-se que a solução cítrica seja pré-aquecida até a faixa de temperatura desejada antes de ser aplicada na lâmina. O micro-ondas pode ser uma maneira conveniente de fazer isso. Um banho-maria, como um fogão sous vide, é a solução mais eficaz e econômica para incubação em alta temperatura. Enxágue a lâmina brevemente em 2x SSC para neutralizar o pH. Digerir o tecido adicionando 100-200 μL (o suficiente para cobrir completamente o tecido, dependendo do tamanho da seção) de tampão de digestão da proteinase K e incubar em RT por 1 min.NOTA: A digestão da proteinase K aumenta ainda mais a acessibilidade das sondas FISH e reduz a autofluorescência. O tempo de digestão deve ser otimizado com base nos tipos de tecido. Na maioria dos casos, 1 minuto de digestão é suficiente. A digestão excessiva leva à morfologia dos núcleos em forma de halo, e o tempo de digestão deve ser reduzido. Pare imediatamente a digestão da proteinase K e desidrate a lâmina imergindo-a em etanol a 70% por 2 min, seguido de tratamento com etanol a 85% e 100% por 2 min cada. 3. FISH e imagens Prepare a mistura de hibridização FISH diluindo 2 μL de estoque de sonda FISH com 8 μL de tampão de hibridização e, em seguida, aplique-o na lâmina. Cubra a amostra com uma lamínula.NOTA: O estoque total de sonda FISH usado varia de 0,5 a 4 μL, dependendo da qualidade da imagem. Se o sinal estiver muito baixo, aumente a entrada da sonda. Reduza a entrada da sonda FISH se o fundo for muito alto, especialmente quando forem observados detritos fluorescentes fora dos núcleos. O tampão de hibridização pode ser aquele fornecido com as sondas adquiridas comercialmente ou preparado como na seção 1. Coloque as lâminas em uma placa quente, como um sistema de hibridização de fosso de lâminas, para desnaturar o DNA a 75 ° C por 2-5 min. Em seguida, transfira a corrediça para outra placa de aquecimento regulada a 37 °C para hibridizar durante a noite.NOTA: Se a placa de aquecimento tiver uma bandeja ou reservatório de água para manter a umidade durante a hibridização, é desnecessário selar a lamínula com cimento de borracha. Após a hibridização, mergulhe a lâmina em 40-60 °C aquecido 0,4x SSC com 0,3% de tampão de lavagem IGEPAL CA-630 e, em seguida, remova cuidadosamente a lamínula. Continue a lavagem duas vezes por 5 minutos cada no escuro, com agitação nos primeiros 10-15 s.NOTA: Mergulhar a corrediça no tampão de lavagem ajuda a liberar suavemente a lamínula. Lave a lâmina em SSC com 0,1% IGEPAL CA-630 por 5 min em RT no escuro, com agitação nos primeiros 10-15 s. Para extinguir a autofluorescência, trate a lâmina com o kit de têmpera de autofluorescência (consulte a Tabela de Materiais) aplicando 150 μL de reagente (50 μL + 50 μL + 50 μL de reagentes A, B, C) por 2-5 min e, em seguida, lave-o com 2x SSC por 5 min.NOTA: Esta é uma etapa opcional. A autofluorescência tecidual origina-se principalmente de componentes da matriz extracelular, como colágeno e elastina. Também é significativamente influenciado por lisossomos e mitocôndrias devido ao seu conteúdo de lipofuscina, NADPH e flavina coenzima. A fixação de aldeídos e a presença de células sanguíneas também podem aumentar bem a autofluorescência13,14. Manchar a lâmina com DAPI durante 10 min. Enxágue a lâmina com 2x SSC tampão por 5 min.NOTA: Se a lâmina não for tratada pelo kit de têmpera de autofluorescência, a coloração DAPI pode ser reduzida para 2 min. Mergulhe rapidamente a lâmina em água deionizada por não mais de 1 s e, em seguida, seque-a rapidamente absorvendo a umidade extra com uma toalha de papel.NOTA: Esta é uma etapa opcional. O tratamento de água deionizada evita efetivamente a deposição de cristais de sal do tampão SSC na lâmina e melhora a qualidade da imagem. No entanto, sob condições de íons tão baixos, as ligações de hidrogênio entre a sonda FISH e o DNA alvo são enfraquecidas, levando à dissociação da sonda e perda de sinal. Portanto, manter a etapa de tratamento da água por um tempo muito curto é crucial. Seque o slide e monte-o com mídia de montagem antidesbotamento. Sele a lamínula com esmalte antes de fazer a imagem.NOTA: Se a lâmina for tratada com reagente de têmpera de autofluorescência, monte a lâmina com um meio de montagem antidesbotamento de acordo com as instruções do fabricante. Além disso, dependendo do tipo de meio de montagem, endurecimento ou não, a amostra deve ser curada por 1-24 h antes da selagem e imagem. Recomenda-se que a amostra seja curada pelo menos durante a noite para obter o melhor índice de refração para imagem. Use uma lente de óleo de 60× para capturar o sinal de fluorescência. Use o canal DAPI para ajustar o foco. Certifique-se de obter várias pilhas Z. Normalmente, 5-10 pilhas z com um intervalo de 1 μm são suficientes. Realize uma projeção 3D máxima para obter a melhor resolução. Aplique algoritmos de deconvolução ou outros algoritmos de limpeza de fundo para melhorar ainda mais a qualidade da imagem.