JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Cancer Research

الكشف القوي عن تضخيم الجينات في العينات المضمنة بالبارافين الثابتة بالفورمالين عن طريق التهجين الفلوري في الموقع

Published: July 12, 2024
doi:
10.3791/66978
, ,
1Children’s Medical Center Research Institute,University of Texas Southwestern Medical Center, 2Department of Pathology,University of Texas Southwestern Medical Center

Summary

يوفر هذا البروتوكول طريقة قابلة للتكرار لتصور تضخيم الجينات في عينات الأنسجة المضمنة بالبارافين (FFPE) المثبتة بالفورمالين.

Abstract

يلعب تضخيم الجينات البؤري، مثل الحمض النووي خارج الكروموسومات (ecDNA)، دورا مهما في تطور السرطان ومقاومة العلاج. في حين أن المنهجيات القائمة على التسلسل تمكن من تحديد غير متحيز للحمض النووي ecDNA ، فإن التقنيات القائمة على الوراثة الخلوية ، مثل التهجين الفلوري في الموقع (FISH) ، تظل فعالة من حيث الوقت والتكلفة لتحديد ecDNA في العينات السريرية. يوفر تطبيق FISH في عينات الأنسجة المثبتة بالبارافين (FFPE) وسيلة فريدة للكشف عن الجينات المضخمة ، خاصة عندما لا تتوفر عينات قابلة للحياة لفحص النمط النووي. ومع ذلك ، هناك نقص في إجراءات توافق الآراء لهذه التقنية. يوفر هذا البروتوكول تعليمات شاملة ومحسنة بالكامل خطوة بخطوة لإجراء FISH للكشف عن تضخيم الجينات ، بما في ذلك ecDNA ، في عينات أنسجة FFPE التي تمثل تحديات فريدة يهدف هذا البروتوكول إلى التغلب عليها وتوحيدها. باتباع هذا البروتوكول ، يمكن للباحثين الحصول على بيانات تصوير عالية الجودة لتقييم تضخيم الجينات.

Introduction

تعد دراسة تضخيم الجينات السرطانية البؤرية أمرا بالغ الأهمية لأنها تدفع تكوين السرطان وتقدمه ومقاومة العلاج1. الأهم من ذلك ، قد تتضخم الجينات المسرطنة والجينات المناعية كحمض نووي خارج الكروموسومات (ecDNA) ، والتي يعزز وراثتها غير المتماثلة عدم التجانس الجيني في السرطان 2,3. تم ربط ecDNA بمقاومة العلاج والنتائج السريرية غير المواتية4،5،6.

تمثل عينات الأنسجة المضمنة في البارافين المثبتة بالفورمالين (FFPE) موردا أرشيفيا واسعا في مختبرات علم الأمراض ، مما يوفر معلومات وفيرة للدراسات بأثر رجعي. ومع ذلك ، فإن استخراج البيانات الجزيئية من عينات FFPE من خلال تفاعل البوليميراز المتسلسل أو التسلسل يمثل تحديا بسبب تجزئة الحمض النووي وتدهوره وربطه أثناء التثبيت7. من بين مجموعة التقنيات المتاحة للتحليل الجزيئي لأنسجة FFPE ، أثبت التهجين الفلوري في الموقع (FISH) فعاليته في تصور تسلسلات الحمض النوويالمحددة 8.

على الرغم من تقدم تقنيات التشخيص الجزيئي الحديثة ، فإن قدرة FISH على تصور وقياس تضخيم الجينات على مستوى الخلية الواحدة توفر رؤى قيمة حول الآليات الجزيئية الكامنة وراء تكوين الورم والنتائج السريرية. باستخدام مجسات موسومة بالفلورسنت مكملة للجين المستهدف محل الاهتمام ، يمكن ل FISH حل توطين الجين الورمي بسهولة وقد يستنتج شكل تضخيم الجينات المسرطنة (مثل ecDNA) داخل الخلايا الفردية ، وهو أمر مستحيل أو مكلف من خلال تقنيات أخرى. لذلك ، يوفر FISH طريقة اقتصادية لتقييم عدم تجانس الورم والتطور النسيلي9. علاوة على ذلك ، سهلت التطورات في الأتمتة والتصوير والتحليل الحسابي التحليل عالي الإنتاجية لبيانات FISH ، مما مكن من القياس الكمي القوي لتضخيم الجينات عبر مجموعات الأنسجة الكبيرة10.

ومع ذلك ، فإن تطبيق FISH على أنسجة FFPE يمثل تحديات متأصلة ، بما في ذلك القطع الأثرية المتشابكة والتألق الذاتي في الخلفية. يتطلب التغلب على هذه العقبات تحسينا دقيقا لكل إجراء لضمان نتائج دقيقة وقابلة للتكرار. توفر هذه الورقة بروتوكولا محسنا خطوة بخطوة لتطبيق FISH للتحقيق في تضخيم الجينات في عينات أنسجة FFPE. باستخدام مسبار يستهدف موضع الجين ERBB2 (HER2) ، أثبتنا أن FISH يمكنه اكتشاف حالة تضخيم ERBB2 بقوة في عينات FFPE من مرضى سرطان الثدي. من الممكن حتى تقدير ما إذا كان ERBB2 يتم تضخيمه على أنه ecDNAs. من خلال تجميع الأدبيات الموجودة ونتائجنا التجريبية ، نوضح الاعتبارات المنهجية والتحديات التقنية والمزالق المحتملة للتحليل القائم على FISH. نناقش أيضا الأهمية السريرية لتوصيف التضخيم الجيني في أنواع مختلفة من السرطان ، مع تسليط الضوء على أهميتها النذير وإمكاناتها للاستراتيجيات العلاجية الشخصية.

باختصار ، تؤكد هذه الورقة على أهمية FISH كأداة قيمة لدراسة تضخيم الجينات في عينات أنسجة FFPE ، وتقديم رؤى لا مثيل لها في بيولوجيا الورم وتوجيه عملية صنع القرار السريري في علم الأورام. مع استمرار التحسين والتكامل مع المقايسات الجزيئية التكميلية ، يقف التحليل القائم على FISH على أهبة الاستعداد لزيادة تعزيز فهمنا لمسببات السرطان وتحسين نتائج المرضى في عصر الطب الدقيق.

Protocol

تمت الموافقة على بروتوكول البحث هذا من قبل مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) التابع للمركز الطبي الجنوبي الغربي بجامعة تكساس. تم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع المرضى قبل الجراحة. 1. الكواشف وإعداد المواد قم بإعداد محلول كلوريد الصوديوم 0.2 نيوتن (HCl) في غطاء دخان عن طريق إضافة 8.212 مل من حمض الهيدروكلوريك ببطء (37٪ وزن / وزن أو 12.1 نيوتن) إلى 491.788 مل من ddH2O. يخزن في درجة حرارة الغرفة (RT).تنبيه: أضف الحمض ببطء إلى الماء. لا تضيف الماء إلى الحمض. تحضير محلول حامض الستريك 10 mM (pH 6.0) عن طريق إذابة 1.47 g من سترات ثلاثي الصوديوم (ثنائي الهيدرات) في 400 مل من ddH2O. استخدم حمض الهيدروكلوريك للتكيف مع الرقم الهيدروجيني 6.0 ، ثم ارفع الحجم النهائي إلى 500 مل مع ddH2O. قم بتخزين المخزن المؤقت في RT. قم بإعداد محلول Tween-20 بنسبة 10٪ بإضافة 100 ميكرولتر من Tween-20 إلى 900 ميكرولتر من ddH2O. قم بتخزينه في RT. قم بإعداد محلول IGEPAL بنسبة 10٪ بإضافة 5 مل من IGEPAL CA-630 إلى 45 مل من ddH2O. قم بتخزينه في RT. قم بإعداد محلول 20x SSC (درجة الحموضة 7.0 ، 3 M كلوريد الصوديوم ، 0.3 M سيترات الصوديوم) عن طريق إذابة 44.1 جم من سترات الصوديوم الثلاثية (ثنائي الهيدرات) و 87.65 جم من كلوريد الصوديوم (NaCl) في 900 مل من ddH2O. استخدم حمض الهيدروكلوريك للتكيف مع الرقم الهيدروجيني 7.0 ، ثم ارفع الحجم النهائي إلى 1000 مل باستخدام ddH2O. قم بتخزين المخزن المؤقت في RT. قم بإعداد محلول 2x SSC بإضافة 100 مل من 20x SSC إلى 900 مل من ddH2O. إذا لزم الأمر ، أضف 0.5 مل من المواد الحافظة (جدول المواد). قم بتخزينه في RT. قم بإعداد مخزن تهجين المسبار عن طريق خلط 910 ميكرولتر من ddH2O ، و 500 ميكرولتر من 20x SSC ، و 50 ميكرولتر من 10٪ Tween-20 ، و 40 ميكرولتر من RNase A ، و 1 مل من 50٪ كبريتات ديكستران ، و 2.5 مل من الفورماميد. القسمة إلى 1 مل وتخزينها في -20 درجة مئوية. قم بإعداد 0.4x SSC بمحلول IGEPAL بنسبة 0.3٪ عن طريق خلط 100 مل من 2x SSC و 15 مل من 10٪ IGEPAL و 385 مل من ddH2O. قم بتخزينه في RT. قم بإعداد 2x SSC بمحلول IGEPAL بنسبة 0.1٪ بإضافة 5 مل من 10٪ IGEPAL إلى 495 مل من محلول 2x SSC. قم بتخزينه في RT. قم بإعداد محلول الهضم Proteinase K حديثا قبل الاستخدام عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من Proteinase K إلى 99 ميكرولتر من المخزن المؤقت Tris-EDTA. قم بإعداد مخزون تخزين DAPI 1 مجم / مل عن طريق إذابة 1 مجم من DAPI في 1 مل من ddH2O. قم بتخزينه في -20 درجة مئوية وبعيدا عن الضوء. قم بإعداد حل عمل DAPI عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من مخزون تخزين DAPI إلى 999 ميكرولتر من محلول 2x SSC. يحفظ بعيدا عن الضوء حتى الاستخدام. 2. عينة المعالجة المسبقة ملاحظة: تحتوي الشريحة المستخدمة هنا على العينة. عمر الشريحة عند 60-90 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة أو طوال الليل (الشكل 1).ملاحظة: تسهل هذه الخطوة ذوبان البارافين. عادة ، 20 دقيقة من التدفئة كافية. يمكن تمديده إلى ليلة واحدة لاستيعاب الجدول الزمني. قم بإزالة الشريحة عن طريق غمرها في الزيلين أو بدائلها في وعاء كوبلين لمدة 10 دقائق. كرر هذه الخطوة مع الزيلين الطازج أو بدائله. قم بإجراء جميع خطوات المعالجة المسبقة والغسيل التالية في جرة كوبلن.ملاحظة: بدائل الزيلين هي بدائل آمنة وصديقة للبيئة للزيلين. أحد البدائل (انظر جدول المواد) يعمل بشكل جيد مثل الزيلين ، إن لم يكن أفضل. على الرغم من أن بدائل الزيلين تنتج رائحة أقل من الزيلين ، إلا أنه يوصى باستخدامه داخل غطاء الدخان. إذا لم يكن من الممكن الوصول إلى بدائل الزيلين ، فإن جميع الإجراءات متوافقة مع إزالة البارفين القائم على الزيلين دون أي تغييرات. اغسل بديل الزيلين بالإيثانول 100٪ لمدة 5 دقائق. أعد ترطيب الشريحة بغمر الإيثانول بنسبة 70٪ لمدة 5 دقائق. اغمر الشريحة في 0.2 نيوتن حمض الهيدروكلوريك (HCl) في RT لمدة 20 دقيقة.ملاحظة: يستخرج حمض الهيدروكلوريك بشكل فعال البروتينات القابلة للذوبان في الحمض ، مثل البروتينات النووية الأساسية ، لتحسين إمكانية الوصول إلى الحمض النووي لمجسات FISH11. اغمر الشريحة في 10 مللي متر من محلول حامض الستريك الساخن واحتضانها عند 90-95 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.ملاحظة: العلاج بحمض الستريك تحت درجات حرارة عالية يستخرج بالمثل البروتينات القابلة للذوبان في الحمض. يعتقد أن كلا العلاجين الحمضيين يستخرجان بروتينات مصفوفة خارج الخلية لتقليل التألق الذاتي12. يوصى بتسخين محلول الستريك مسبقا إلى نطاق درجة الحرارة المطلوب قبل تطبيقه على الشريحة. يمكن أن يكون الميكروويف طريقة ملائمة للقيام بذلك. الحمام المائي ، كما هو الحال مع طباخ سو فيد ، هو الحل الأكثر فعالية واقتصادية لحضانة درجات الحرارة العالية. اشطف الشريحة لفترة وجيزة في 2x SSC لتحييد درجة الحموضة. هضم الأنسجة عن طريق إضافة 100-200 ميكرولتر (ما يكفي لتغطية الأنسجة بالكامل اعتمادا على حجم القسم) من مخزن الهضم Proteinase K واحتضانه في RT لمدة 1 دقيقة.ملاحظة: يزيد هضم Proteinase K من إمكانية الوصول إلى مجسات FISH ويقلل من التألق الذاتي. يجب تحسين وقت الهضم بناء على أنواع الأنسجة. في معظم الحالات ، 1 دقيقة من الهضم كافية. يؤدي الإفراط في الهضم إلى مورفولوجيا نوى على شكل هالة ، ويجب تقليل وقت الهضم. أوقف على الفور هضم Proteinase K وقم بتجفيف الشريحة عن طريق غمرها في 70٪ إيثانول لمدة دقيقتين ، تليها معالجة الإيثانول بنسبة 85٪ و 100٪ لمدة دقيقتين لكل منهما. 3. الأسماك والتصوير قم بإعداد مزيج تهجين FISH عن طريق تخفيف 2 ميكرولتر من مخزون مسبار FISH مع 8 ميكرولتر من محلول التهجين ، ثم ضعه على الشريحة. قم بتغطية العينة بغطاء.ملاحظة: يتراوح إجمالي مخزون مسبار FISH المستخدم من 0.5-4 ميكرولتر ، اعتمادا على جودة الصورة. إذا كانت الإشارة منخفضة جدا ، فقم بزيادة إدخال المسبار. قلل من مدخلات مسبار FISH إذا كانت الخلفية عالية جدا ، خاصة عند ملاحظة حطام الفلورسنت خارج النوى. يمكن أن يكون المخزن المؤقت للتهجين هو الذي يتم توفيره مع المجسات المشتراة تجاريا أو يتم إعداده كما في القسم 1. ضع الشرائح على طبق ساخن ، مثل نظام تهجين الخندق المنزلق ، لتشويه الحمض النووي عند 75 درجة مئوية لمدة 2-5 دقائق. بعد ذلك ، انقل الشريحة إلى طبق ساخن آخر على درجة حرارة 37 درجة مئوية للتهجين طوال الليل.ملاحظة: إذا كانت اللوحة الساخنة تحتوي على صينية مياه أو خزان للحفاظ على الرطوبة أثناء التهجين ، فإن إغلاق غطاء الغطاء بالأسمنت المطاطي غير ضروري. بعد التهجين ، اغمس الشريحة في 40-60 درجة مئوية دافئة 0.4x SSC مع 0.3٪ IGEPAL CA-630 عازلة للغسيل ، ثم قم بإزالة غطاء الغطاء بعناية. استمر في الغسيل مرتين لمدة 5 دقائق لكل منهما في الظلام ، مع التحريك لأول 10-15 ثانية.ملاحظة: يساعد غمس الشريحة في المخزن المؤقت للغسيل على تحرير انزلاق الغطاء برفق. اغسل الشريحة في SSC بنسبة 0.1٪ IGEPAL CA-630 لمدة 5 دقائق في RT في الظلام ، مع الإثارة لأول 10-15 ثانية. لإخماد التألق الذاتي ، عالج الشريحة باستخدام مجموعة التبريد ذاتية التألق (انظر جدول المواد) عن طريق تطبيق 150 ميكرولتر من الكاشف (50 ميكرولتر + 50 ميكرولتر + 50 ميكرولتر من الكواشف A ، B ، C) لمدة 2-5 دقائق ، ثم اغسلها ب 2x SSC لمدة 5 دقائق.ملاحظة: هذه خطوة اختيارية. ينشأ التألق الذاتي للأنسجة بشكل أساسي من مكونات المصفوفة خارج الخلية ، مثل الكولاجين والإيلاستين. كما أنه يتأثر بشكل كبير بالليزوزومات والميتوكوندريا بسبب محتواها من الليبوفوسين و NADPH وأنزيم الفلافين. قد يؤدي تثبيت الألدهيد ووجود خلايا الدم أيضا إلى زيادة التألق الذاتيبشكل جيد 13,14. تلطيخ الشريحة مع DAPI لمدة 10 دقائق. اشطف الشريحة بمخزن مؤقت 2x SSC لمدة 5 دقائق.ملاحظة: إذا لم تتم معالجة الشريحة بواسطة مجموعة التبريد ذاتية التألق ، فيمكن تقليل تلطيخ DAPI إلى 2 دقيقة. اغمس الشريحة بسرعة في الماء منزوع الأيونات لمدة لا تزيد عن 1 ثانية ، ثم جففها بسرعة عن طريق امتصاص الرطوبة الزائدة بمنشفة ورقية.ملاحظة: هذه خطوة اختيارية. تمنع معالجة المياه منزوعة الأيونات بشكل فعال ترسب بلورات الملح للمخزن المؤقت SSC على الشريحة وتحسن جودة التصوير. ومع ذلك ، في ظل هذه الظروف الأيونات المنخفضة ، تضعف الروابط الهيدروجينية بين مسبار FISH والحمض النووي المستهدف ، مما يؤدي إلى تفكك المسبار وفقدان الإشارة. لذلك ، فإن الحفاظ على خطوة معالجة المياه لفترة قصيرة جدا أمر بالغ الأهمية. جفف الشريحة ، ثم قم بتركيبها باستخدام وسائط تثبيت مانعة للتلاشي. أغلق غطاء الغطاء بطلاء الأظافر قبل التصوير.ملاحظة: إذا تمت معالجة الشريحة بواسطة كاشف التبريد ذاتي التألق ، فقم بتركيب الشريحة بوسيط تركيب مضاد للتلاشي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. علاوة على ذلك ، اعتمادا على نوع وسائط التركيب ، تصلب أو عدم تصلب ، يجب معالجة العينة لمدة 1-24 ساعة قبل الختم والتصوير. يوصى بمعالجة العينة بين عشية وضحاها على الأقل لتحقيق أفضل معامل انكسار للتصوير. استخدم عدسة زيتية 60× لالتقاط إشارة مضان. استخدم قناة DAPI لضبط التركيز. تأكد من الحصول على مكدسات Z متعددة. عادة ما تكون مداخن z 5-10 مع فاصل 1 ميكرومتر كافية. أداء أقصى إسقاط 3D لتحقيق أفضل قرار. قم بتطبيق فك الالتفاف أو خوارزميات مسح الخلفية الأخرى لتحسين جودة الصورة بشكل أكبر.

Representative Results

استخدمنا عينات FFPE من كل من سرطانات الثدي الإيجابية والسلبية HER2 لإثبات نتيجة تصوير FISH. يعد تضخيم HER2 (المشفر بواسطة جين ERBB2 ) علامة مواتية نظرا لتوافر وفعالية علاجات الاستهداف الجزيئي HER2. على العكس من ذلك ، فإن المرضى الذين يعانون من سرطانات الثدي الثلاثية السلبية ، والتي تفتقر إلى التعبير عن HER2 ، ومستقبلات هرمون الاستروجين (ER) ، ومستقبلات البروجسترون (PR) ، يواجهون نتائج سيئة بسبب الخيارات العلاجية المحدودة. لذلك ، فإن تحديد حالة HER2 أمر بالغ الأهمية في أبحاث سرطان الثدي وعلاجه15. في عينة سرطان الثدي الثلاثية السلبية ، تعرض معظم النوى نقطتين متميزتين تمثلان إشارات HER2 / ERBB2 FISH. قد تحتوي بعض النوى على نقطة واحدة فقط بسبب تحيز التقسيم (الشكل 2 ، على اليسار). في المقابل ، تقدم العينات الإيجابية HER2 إشارات FISH وفيرة بنمطين مختلفين. يظهر أحد الأنماط نقاطا متناثرة في جميع أنحاء النواة (الشكل 2 ، الوسط). هذا النمط هو سمة من سمات مورفولوجيا ecDNA ، حيث قد لا تحتل ecDNAs منطقة نووية فريدة ومنظمة16. علاوة على ذلك ، يؤدي الفصل غير المتماثل ل ecDNAs أثناء الانقسام إلى اختلاف عدد النسخ ، مما يؤدي إلى عدم تجانس الإشارة بين النوى17. قد تظهر بعض النوى مجموعات عرضية ، مما يدل على محاور ecDNA18 (الشكل 2 ، يمين). يعرض النوع الآخر من تضخيم HER2 بشكل أساسي الركام المكثف على شكل قضيب. من المحتمل أن يشير هذا التشكل إلى التضخيم القائم على الكروموسومات ، مثل مناطق التلوين المتجانسة (HSR) 19 أو من خلال دورة جسر الانصهار والكسر (BFB)20. والجدير بالذكر أن تضخيم ecDNA و HSR و BFB يمكن أن يتعايش في نفس النواة. لذلك ، يوصى بفحص نوى متعددة لاستنتاج شكل التضخيم البؤري. الشكل 1: رسم تخطيطي ل FISH في عينات FFPE. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 2: صورة FISH التمثيلية في عينات FFPE لسرطان الثدي. التكبير: 600x ؛ شريط المقياس: 10 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

FISH هو خيار سريع وبأسعار معقولة للتشخيص الوراثي الخلوي. خاصة في تحديد ما إذا كان ecDNA موجودا في السرطان ، تظل أدلة FISH هي المعيار الذهبي1. يسمح FISH في أنسجة FFPE بالتحديد السريع لحالة الجينات في عينات خزعة المريض ، مما يسمح بتشخيص أسرع وتتبع التغييرات طوال تقدم المرض. هذه التقنية ذات قيمة خاصة لاختبار العينات السريرية التي تم جمعها بالفعل لعلم الأمراض.

يتضمن هذا البروتوكول عدة خطوات حاسمة. الخطوة الأولى هي إزالة البارافين الشاملة. يمكن أن يعطل البارافين المتبقي تهجين FISH. إذا كانت العينة لا تزال تبدو شمعية بعد الخطوة 2 ، فيجب معالجتها مرة أخرى بالزيلين الطازج أو بدائله.

ثانيا ، استخراج البروتين والهضم أمر بالغ الأهمية. لا تعزز هذه العمليات إمكانية وصول الحمض النووي إلى مسبار FISH فحسب ، بل تقلل أيضا بشكل كبير من التألق التلقائي. يتضمن هذا البروتوكول ثلاث خطوات لإزالة البروتين. في حين أن العلاج ب 0.2 N HCl و 10 mM من حامض الستريك واضح ومباشر ، فقد يتطلب هضم البروتين K التحسين. الإفراط في الهضم هو الخطأ الأكثر شيوعا عند استخدام البروتيناز K ، مما يؤدي إلى نوى على شكل هالة. سيؤدي تقصير وقت الهضم إلى تحسين مورفولوجيا النوى. بالإضافة إلى ذلك ، يوصى بعدم هضم أكثر من أربع عينات في وقت واحد لتقليل فارق التوقيت بين العينة الأولى والأخيرة. من المهم ملاحظة أنه حتى النواة السليمة قد تظهر كهالة تحت المجهر عالي التكبير وعالي الدقة. وذلك لأن النواة ليست على المستوى البؤري نفسه. لذلك ، يقترح أخذ مداخن Z متعددة وإجراء إسقاط أقصى لفحص التشكل النووي.

أخيرا ، يوصى بتبريد التألق الذاتي. على الرغم من أن استخراج الحمض وهضم البروتيناز K يمكن أن يقلل بشكل كبير من الخلفية المشتقة من البروتين ، إلا أن مستقلبات الفلورسنت قد لا تزال تؤثر على جودة التصوير.

بينما يوفر FISH دقة مكانية لا مثيل لها في تحديد تضخيم الجينات البؤري ، إلا أن له قيودا. أولا ، المحتوى والإنتاجية منخفضان مقارنة بنهج PCR أو تسلسل الجيل التالي (NGS). عادة ، يمكن تطبيق واحد إلى ثلاثة مجسات FISH بألوان مختلفة على شريحة واحدة بدون معدات متخصصة. ومع ذلك ، فإن التقدم في تقنيات الأتمتة جعل FISH عالي المحتوى وعالي الإنتاجية ، مثل التسلسل في الموقع 21 ، ممكنا. ثانيا ، يتطلب تصميم مسبار FISH معلومات مسبقة. وقد مكنت الجهود الجارية لتحديد أحداث التضخيم البؤري المتكررة في السرطان من إنشاء لوحات FISH مصممة مسبقا للتطبيقات المختبرية والسريرية. على سبيل المثال ، غالبا ما يتم تضخيم الجينات المسرطنة من عائلة MYC على أنها ecDNA في سرطان الرئة ذو الخلايا الصغيرة للتوسط في مقاومة العلاج الكيميائي. لذلك ، يمكن للوحة FISH التي تستهدف جينات MYC و MYCL و MYCN تسريع تحديد استجابات العلاج في الخزعات. وبالمقارنة ، يسمح NGS بفحص أكثر حيادية للجينات ذات الأهمية. ومع ذلك ، من بين التقنيات القائمة على NGS ، فقط تسلسل الجينوم الكامل مع تحليل مكلفللحساب 22 يمكن أن يميز ecDNA.

باختصار ، نقدم تعليمات قوية وشاملة للتحقيق في تضخيم الجينات البؤري في عينات FFPE. من خلال فحص نمط إشارة FISH ، يصبح من الواضح بشكل لا لبس فيه ما إذا كان يتم تضخيم موضع الجين وكيفية ذلك. نتوقع دمج التعلم الآلي في تحليل الصور23 من نوى الطور البيني لاستخراج المعلومات الوراثية الخلوية فيما يتعلق برقم النسخ وشكل التضخيم (كروموسوم أو ecDNA) ، وبالتالي تبسيط عملية التشخيص الجزيئي وتعزيز فهمنا للآليات المسببة للأمراض في السرطان.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SW هو باحث ومدعوم من معهد الوقاية من السرطان والبحوث في تكساس (RR210034)

Materials

DAPI Tocris Bioscience 5748 Nucleus staining
Dextran sulfate 50% solution EMD Millipore Sigma S4030 Probe hybridization buffer
ERBB2 (HER2) FISH Probe Empire Genomics ERBB2-20-RE FISH probe
Ethanol Decon Labs 2716 Dehydrating and hydrating tissue
Formamide Thermo Scientific Chemicals 205821000 Probe hybridization buffer
Formula 83 (Xylene substitute) CBG Biotech CH0104A Removing paraffin
Hydrochloric acid Fisher Chemical A144-500 Sample pretreatment
IGEPAL CA-630  Thermo Scientific Chemicals J19628K2 Slide washing
Proclin 300 Sigma-Aldrich 48914-U Preservative for SSC buffer (optional)
Proteinase K (800 units/mL) New England Biolabs P8107S Protein digestion
RNase A (20 mg/mL) New England Biolabs T3018L Probe hybridization buffer
Slide Moat Hybridization System Boekel Scientific 280001 Sample denature and hybridization. Alternative hot plates are acceptable.
Sodium chloride Fisher Chemical S2713 SSC buffer
Sodium citrate dihydrate Fisher BioReagents FLBP3271 SSC buffer and sample pretreatment
Tris-EDTA (TE) buffer Fisher BioReagents BP2473500 Proteinase K digestion buffer
Tween-20 Fisher BioReagents BP337-500 Probe hybridization buffer
Vectashield antifade mounting media Vector Laboratories  H190010 Slide mounting
Vector TrueVIEW Vector Laboratories  SP8400 Autofluorescence quenching kit
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. ICGC/TCGA Pan-Cancer Analysis of Whole Genomes Consortium. Pan-cancer analysis of whole genomes. Nature. 578 (7793), 82-93 (2020).
  2. Wu, S., Bafna, V., Chang, H. Y., Mischel, P. S. Extrachromosomal DNA: An emerging hallmark in human cancer. Annu Rev Pathol. 17, 367-386 (2022).
  3. Luebeck, J., et al. Extrachromosomal DNA in the cancerous transformation of Barrett’s oesophagus. Nature. 616 (7958), 798-805 (2023).
  4. Nathanson, D. A., et al. Targeted therapy resistance mediated by dynamic regulation of extrachromosomal mutant EGFR DNA. Science. 343 (6166), 72-76 (2014).
  5. Kim, H., et al. Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers. Nat Genet. 52 (9), 891-897 (2020).
  6. Pal Choudhuri, S., et al. Acquired cross-resistance in small cell lung cancer due to extrachromosomal DNA amplification of MYC paralogs. Cancer Discov. 14 (5), 804-827 (2024).
  7. Greytak, S. R., Engel, K. B., Bass, B. P., Moore, H. M. Accuracy of molecular data generated with FFPE biospecimens: Lessons from the literature. Cancer Res. 75 (8), 1541-1547 (2015).
  8. Chrzanowska, N. M., Kowalewski, J., Lewandowska, M. A. Use of fluorescence in situ hybridization (FISH) in diagnosis and tailored therapies in solid tumors. Molecules. 25 (8), 1864 (2020).
  9. Cui, C., Shu, W., Li, P. Fluorescence in situ hybridization: Cell-based genetic diagnostic and research applications. Front Cell Dev Biol. 4, 89 (2016).
  10. Finn, E. H., Misteli, T. A high-throughput DNA FISH protocol to visualize genome regions in human cells. STAR Protoc. 2 (3), 100741 (2021).
  11. Watters, A. D., Bartlett, J. M. S. Fluorescence in situ hybridization in paraffin tissue sections. Mol Biotechnol. 21 (3), 217-220 (2002).
  12. Richardson, S. O., et al. One-fits-all pretreatment protocol facilitating fluorescence in situ hybridization on formalin-fixed paraffin-embedded, fresh frozen and cytological slides. Mol Cytogenet. 12, 27 (2019).
  13. Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnol Annu Rev. 11, 227-256 (2005).
  14. Davis, A. S., et al. Characterizing and diminishing autofluorescence in formalin-fixed paraffin-embedded human respiratory tissue. J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).
  15. Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
  16. Liang, Z., et al. Chromatin-associated RNA dictates the ecDNA interactome in the nucleus. bioRxiv. , (2023).
  17. Lange, J. T., et al. The evolutionary dynamics of extrachromosomal DNA in human cancers. Nat Genet. 54 (10), 1527-1533 (2022).
  18. Hung, K. L., et al. ecDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression. Nature. 600 (7890), 731-736 (2021).
  19. Storlazzi, C. T., et al. Gene amplification as double minutes or homogeneously staining regions in solid tumors: origin and structure. Genome Res. 20 (9), 1198-1206 (2010).
  20. Guerin, T. M., Marcand, S. Breakage in breakage-fusion-bridge cycle: an 80-year-old mystery. Trends Genet. 38 (7), 641-645 (2022).
  21. Nguyen, H. Q., et al. 3D mapping and accelerated super-resolution imaging of the human genome using in situ sequencing. Nat Methods. 17 (8), 822-832 (2020).
  22. Deshpande, V., et al. Exploring the landscape of focal amplifications in cancer using AmpliconArchitect. Nat Commun. 10 (1), 392 (2019).
  23. Rajkumar, U., et al. EcSeg: Semantic segmentation of metaphase images containing extrachromosomal DNA. iScience. 21, 428-435 (2019).

Tags

Gene AmplificationExtrachromosomal DNAEcDNAFluorescence In Situ HybridizationFISHFormalin-fixed Paraffin-embeddedCancer DevelopmentTherapy ResistanceCytogenetic TechniquesClinical SpecimensKaryotype ExaminationImaging DataProtocol Standardization
This article has been published
Video Coming Soon
Keep me updated:

.

PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gilbreath, C., Peng, Y., Wu, S. Robust Detection of Gene Amplification in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Samples by Fluorescence In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (209), e66978, doi:10.3791/66978 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image