Fluorescence In Situ hybridization에 의한 포르말린 고정 파라핀 포매 시료에서 유전자 증폭의 강력한 검출

이 연구 프로토콜은 텍사스 대학교 사우스웨스턴 메디컬 센터(University of Texas Southwestern Medical Center)의 IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다. 수술 전에 모든 환자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었습니다. 1. 시약 및 재료 준비 0.2 N 염화나트륨 (HCl) 용액을 8.212 mL의 HCl (37 % w / w 또는 12.1 N)를 ddH 491.788 mL의 ddH2O에 천천히 첨가하여 준비합니다. 실온 (RT)에서 보관하십시오.주의 : 물에 산을 천천히 첨가하십시오. 산에 물을 첨가하지 마십시오. 10mL의ddH400 O에 Tri-sodium citrate (dihydrate) 1.47g을 용해시켜 2 mM 구연산 용액 (pH 6.0)을 준비합니다. HCl을 사용하여 pH 6.0으로 조정 한 다음 ddH2O를 사용하여 최종 부피를 500mL로 가져옵니다. 버퍼를 RT에 보관합니다. 100 μL의 Tween-20 내지 900 μL의ddH2O를 첨가하여 10% Tween-20 용액을 제조한다. RT에 보관한다. 5mL의 IGEPAL CA-630에 45mL의ddH2O를 첨가하여 10% IGEPAL 용액을 준비합니다. RT에 보관합니다. ddH2O 900 mL에 구연산삼나트륨(이수화물) 44.1g과 염화나트륨(NaCl) 87.65g을 녹여 2x SSC(pH 7.0, 3M NaCl, 0.3M 구연산나트륨) 용액을 준비합니다. HCl을 사용하여 pH 7.0으로 조정한 다음 ddH2O를 사용하여 최종 부피를 1000mL로 가져옵니다. 완충액을 RT에 보관합니다. 100mL의 20x SSC를ddH2O의 900mL에 첨가하여 2x SSC 용액을 준비합니다. 필요한 경우 0.5mL의 방부제를 추가합니다(재료 표). RT에 보관하십시오. 910 μL의 ddH2O, 500 μL의 20x SSC, 50 μL의 10% Tween-20, 40 μL의 RNase A, 1 mL의 50% 덱스트란 설페이트 및 2.5 mL의 포름아미드를 혼합하여 프로브 혼성화 버퍼를 준비합니다. 1mL에 분취하여 -20 °C에서 보관합니다. 100mL의 2x SSC, 15mL의 10% IGEPAL 및 385mL의ddH2O를 혼합하여 0.4x SSC를 0.3% IGEPAL 용액으로 준비합니다. RT에 보관합니다. 5mL의 10% IGEPAL 용액 495mL에 2x SSC 용액에 0.1% IGEPAL 용액으로 2x SSC를 준비합니다. RT에 보관하십시오. 사용하기 전에 1 μL의 Proteinase K를 99 μL의 Tris-EDTA 완충액에 첨가하여 Proteinase K 분해 완충액을 신선하게 준비합니다. 1mg의 DAPI를 1mL의 ddH2O에 1mg을 용해시켜 DAPI 저장 스톡을 준비합니다. -20 °C에서 빛을 피해 보관하십시오. 1μL의 DAPI 스토리지 스톡을 999μL의 2x SSC 솔루션에 추가하여 DAPI 작업 솔루션을 준비합니다. 사용할 때까지 빛을 피하십시오. 2. 시료 전처리 알림: 여기에 사용된 슬라이드에는 표본이 포함되어 있습니다. 슬라이드를 60-90°C에서 20분 또는 하룻밤 동안 숙성시킵니다(그림 1).알림: 이 단계는 파라핀 용융을 용이하게 합니다. 일반적으로 20분의 가열로 충분합니다. 일정에 맞게 하룻밤까지 연장할 수 있습니다. 슬라이드를 자일렌 또는 그 대체품에 10분 동안 코플린 병에 담가 탈파라핀화합니다. 신선한 크실렌 또는 그 대체품으로 이 단계를 반복합니다. Coplin 항아리에서 다음의 모든 전처리 및 세척 단계를 수행하십시오.알림: 크실렌 대체품은 자일렌에 대한 안전하고 친환경적인 대안입니다. 대체품 중 하나( 재료 표 참조)는 크실렌만큼 성능이 좋지는 않더라도 성능이 좋습니다. 자일렌 대체품은 자일렌보다 냄새가 적지만 흄 후드 내부에 사용하는 것이 좋습니다. 자일렌 대체품에 접근할 수 없는 경우, 모든 절차는 변경 없이 자일렌 기반 탈파라핀화와 호환됩니다. 크실렌 대체품을 100% 에탄올로 5분 동안 씻어냅니다. 70% 에탄올을 5분 동안 담근 슬라이드에 수분을 보충합니다. 슬라이드를 RT에서 0.2N 염산(HCl)에 20분 동안 담그십시오.참고: HCl은 염기성 핵 단백질과 같은 산성 단백질을 효과적으로 추출하여 FISH 프로브11에 대한 DNA 접근성을 향상시킵니다. 슬라이드를 10mM의 뜨거운 구연산 용액에 담그고 90-95°C에서 20분 동안 배양합니다.참고: 고온에서 구연산 처리는 유사하게 산성 용해성 단백질을 추출합니다. 두 가지 산 처리 모두 세포외 기질 단백질을 추출하여 자가형광을 감소시키는 것으로 생각된다12. 구연산 용액을 슬라이드에 적용하기 전에 원하는 온도 범위로 예열하는 것이 좋습니다. 전자레인지는 그렇게 하는 편리한 방법이 될 수 있습니다. 수비드 쿠커와 같은 수조는 고온 배양을 위한 가장 효과적이고 경제적인 솔루션입니다. pH를 중화하기 위해 슬라이드를 2x SSC로 잠시 헹굽니다. Proteinase K 분해 완충액 100-200 μL(절편의 크기에 따라 조직을 완전히 덮을 수 있을 만큼)를 추가하여 조직을 분해하고 RT에서 1분 동안 배양합니다.참고: Proteinase K 분해는 FISH 프로브의 접근성을 더욱 높이고 자가형광을 감소시킵니다. 소화 시간은 조직 유형에 따라 최적화해야 합니다. 대부분의 경우 1분의 소화 시간이면 충분합니다. 과잉 소화는 후광 모양의 핵 형태를 유발하며 분해 시간을 줄여야 합니다. Proteinase K 분해를 즉시 중지하고 슬라이드를 70% 에탄올에 2분 동안 담근 다음 85% 및 100% 에탄올을 각각 2분 동안 처리하여 탈수합니다. 3. 물고기와 이미징 2 μL의 FISH 프로브 스톡을 8 μL의 혼성화 완충액으로 희석하여 FISH 혼성화 혼합물을 준비한 다음 슬라이드에 적용합니다. 커버슬립으로 샘플을 덮습니다.참고: 사용된 총 FISH 프로브 스톡은 이미지 품질에 따라 0.5-4 μL 범위입니다. 신호가 너무 낮으면 프로브 입력을 늘리십시오. 배경이 너무 높은 경우, 특히 핵 외부의 형광 파편이 관찰되는 경우 FISH 프로브 입력을 줄이십시오. 혼성화 완충액은 상업적으로 구매된 프로브와 함께 제공되거나 섹션 1과 같이 제조된 것일 수 있다. 슬라이드를 슬라이드 해자 교잡 시스템과 같은 핫 플레이트에 놓고 75°C에서 2-5분 동안 DNA를 변성시킵니다. 그런 다음 슬라이드를 37°C로 설정된 다른 핫 플레이트로 옮겨 밤새 하이브리드화합니다.알림: 핫 플레이트에 혼성화 중 습도를 유지하기 위해 물통 또는 물통이 있는 경우 고무 시멘트로 커버슬립을 밀봉할 필요가 없습니다. 하이브리드화 후 슬라이드를 40-60°C로 데워진 0.4x SSC와 0.3% IGEPAL CA-0.30 세척 버퍼에 담근 다음 커버슬립을 조심스럽게 제거합니다. 처음 5-10초 동안 교반하면서 각각 15분 동안 두 번 세탁을 계속합니다.알림: 슬라이드를 세탁 버퍼에 담그면 커버슬립을 부드럽게 해제하는 데 도움이 됩니다. 처음 10-15초 동안 교반하면서 어둠 속에서 RT에서 5분 동안 0.1% IGEPAL CA-630으로 SSC에서 슬라이드를 세척합니다. 자가형광을 소멸시키려면 150μL의 시약(50μL + 50μL + 50μL의 시약 A, B, C)을 2-5분 동안 적용하여 슬라이드를 자가형광 소멸 키트( 재료 표 참조)로 처리한 다음 2x SSC로 5분 동안 세척합니다.참고: 이 단계는 선택 사항입니다. 조직 자가형광은 주로 콜라겐 및 엘라스틴과 같은 세포외 기질 구성 요소에서 비롯됩니다. 또한 리소좀과 미토콘드리아의 리포푸신, NADPH, 플라빈 코엔자임 함량에 크게 영향을 받습니다. 알데히드 고정 및 혈액 세포의 존재는 또한 자가형광을 잘 증가시킬 수 있습니다13,14. 10분 동안 DAPI로 슬라이드를 염색합니다. 2x SSC 버퍼로 슬라이드를 5분 동안 헹굽니다.참고: 슬라이드가 자가형광 소멸 키트로 처리되지 않으면 DAPI 염색을 2분으로 줄일 수 있습니다. 슬라이드를 탈이온수에 1초 이상 담근 다음 종이 타월로 추가 수분을 흡수하여 빠르게 건조시킵니다.참고: 이 단계는 선택 사항입니다. 탈이온수 처리는 슬라이드에 SSC 완충액의 염 결정 침착을 효과적으로 방지하고 이미징 품질을 향상시킵니다. 그러나 이러한 낮은 이온 조건에서는 FISH 프로브와 표적 DNA 사이의 수소 결합이 약화되어 프로브 해리 및 신호 손실이 발생합니다. 따라서 매우 짧은 시간 동안 수처리 단계를 유지하는 것이 중요합니다. 슬라이드를 건조시킨 다음 페이드 방지 장착 미디어로 장착합니다. 이미징하기 전에 매니큐어로 커버슬립을 밀봉하십시오.알림: 슬라이드가 자가형광 소멸 시약으로 처리되는 경우 제조업체의 지침에 따라 페이드 방지 장착 매체를 사용하여 슬라이드를 장착합니다. 또한 장착 매체의 유형, 경화 또는 비경화에 따라 샘플은 밀봉 및 이미징 전에 1-24시간 동안 경화되어야 합니다. 이미징을 위한 최상의 굴절률을 얻기 위해 샘플을 최소한 하룻밤 동안 경화하는 것이 좋습니다. 60× oil lens를 사용하여 형광 신호를 캡처합니다. DAPI 채널을 사용하여 포커스를 조정합니다. 여러 Z-스택을 확보해야 합니다. 일반적으로 1μm 간격의 5-10 z 스택으로 충분합니다. 최상의 해상도를 얻기 위해 최대 3D 투영을 수행합니다. 디콘볼루션(deconvolution) 또는 기타 배경 지우기 알고리즘을 적용하여 이미지 품질을 더욱 향상시킬 수 있습니다.