Detección robusta de la amplificación génica en muestras fijadas en formol e incluidas en parafina mediante hibridación fluorescente in situ

Este protocolo de investigación fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB, por sus siglas en inglés) del Centro Médico Southwestern de la Universidad de Texas. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes antes de la cirugía. 1. Preparación de reactivos y materiales Prepare la solución de cloruro de sodio (HCl) 0.2 N en una campana extractora agregando lentamente 8.212 mL de HCl (37% p/p o 12.1 N) a 491.788 mL de ddH2O. Almacene a temperatura ambiente (RT).PRECAUCIÓN: Agregue lentamente el ácido al agua. No agregue agua al ácido. Prepare 10 mM de solución de ácido cítrico (pH 6.0) disolviendo 1.47 g de citrato trisódico (dihidratado) en 400 mL de ddH2O. Use HCl para ajustar a pH 6.0 y luego lleve el volumen final a 500 mL con ddH2O. Almacene el tampón a RT. Prepare la solución de Tween-20 al 10% añadiendo 100 μL de Tween-20 a 900 μL de ddH2O. Guárdela en RT. Prepare la solución de IGEPAL al 10% añadiendo 5 mL de IGEPAL CA-630 a 45 mL de ddH2O. Guárdela en RT. Prepare la solución 20x SSC (pH 7.0, 3 M NaCl, 0.3 M de citrato de sodio) disolviendo 44.1 g de citrato trisódico (dihidratado) y 87.65 g de cloruro de sodio (NaCl) en 900 mL de ddH2O. Use HCl para ajustar a pH 7.0 y luego lleve el volumen final a 1000 mL con ddH2O. Almacene el tampón en RT. Prepare la solución de SSC 2x agregando 100 mL de SSC 20x a 900 mL de ddH2O. Si es necesario, agregue 0,5 mL de conservante (Tabla de Materiales). Guárdalo en RT. Prepare el tampón de hibridación de la sonda mezclando 910 μL de ddH2O, 500 μL de SSC 20x, 50 μL de Tween-20 al 10%, 40 μL de RNasa A, 1 mL de sulfato de dextrano al 50% y 2,5 mL de formamida. Alícuota en 1 mL y almacenarlos a -20 °C. Prepare el SSC 0.4x con solución de IGEPAL al 0.3% mezclando 100 mL de 2x SSC, 15 mL de IGEPAL al 10% y 385 mL de ddH2O. Guárdelo en RT. Prepare el 2x SSC con una solución de IGEPAL al 0,1% añadiendo 5 mL de IGEPAL al 10% a 495 mL de solución 2x SSC. Guárdalo en RT. Prepare el tampón de digestión Proteinasa K antes de usarlo añadiendo 1 μL de Proteinasa K a 99 μL de tampón Tris-EDTA. Prepare 1 mg/mL de DAPI disolviendo 1 mg de DAPI en 1 mL de ddH2O. Guárdelo a -20 °C y lejos de la luz. Prepare la solución de trabajo DAPI agregando 1 μL de stock de almacenamiento DAPI a 999 μL de solución SSC 2x. Mantener alejado de la luz hasta su uso. 2. Pretratamiento de la muestra NOTA: El portaobjetos utilizado aquí contiene el espécimen. Envejezca el portaobjetos a 60-90 °C durante 20 minutos o toda la noche (Figura 1).NOTA: Este paso facilita la fusión de la parafina. Por lo general, 20 minutos de calentamiento son suficientes. Se puede extender a toda la noche para acomodar el horario. Desparafina el portaobjetos sumergiéndolo en xileno o sus sustitutos en un frasco Coplin durante 10 min. Repita este paso con xileno fresco o sus sustitutos. Realice todos los siguientes pasos de pretratamiento y lavado en un frasco Coplin.NOTA: Los sustitutos del xileno son alternativas seguras y ecológicas al xileno. Uno de los sustitutos (ver Tabla de Materiales) funciona tan bien como el xileno, si no mejor. Aunque los sustitutos del xileno producen menos olor que el xileno, se recomienda usarlo dentro de una campana extractora. Si no se dispone de sustitutos del xileno, todos los procedimientos son compatibles con la desparafinación a base de xileno sin ningún cambio. Lave el sustituto de xileno con etanol al 100% durante 5 minutos. Rehidrate el portaobjetos con inmersión en etanol al 70% durante 5 min. Sumerja el portaobjetos en ácido clorhídrico (HCl) 0,2 N a RT durante 20 min.NOTA: El HCl extrae eficazmente proteínas solubles en ácido, como las proteínas nucleares básicas, para mejorar la accesibilidad del ADN a las sondas FISH11. Sumerja el portaobjetos en 10 mM de solución caliente de ácido cítrico e incube a 90-95 °C durante 20 min.NOTA: El tratamiento con ácido cítrico a altas temperaturas extrae de manera similar las proteínas solubles en ácido. Se cree que ambos tratamientos ácidos extraen proteínas de la matriz extracelular para disminuir la autofluorescencia12. Se recomienda que la solución cítrica se precaliente al rango de temperatura deseado antes de aplicarla al portaobjetos. El microondas puede ser una forma conveniente de hacerlo. Un baño de agua, como el de una olla sous vide, es la solución más eficaz y económica para la incubación a alta temperatura. Enjuague el portaobjetos brevemente con 2x SSC para neutralizar el pH. Digiera el tejido añadiendo 100-200 μL (suficiente para cubrir completamente el tejido dependiendo del tamaño de la sección) de tampón de digestión Proteinasa K e incubar a RT durante 1 min.NOTA: La digestión de la proteinasa K aumenta aún más la accesibilidad a las sondas FISH y reduce la autofluorescencia. El tiempo de digestión debe optimizarse en función de los tipos de tejido. En la mayoría de los casos, 1 minuto de digestión es suficiente. La digestión excesiva conduce a una morfología de los núcleos en forma de halo, y el tiempo de digestión debe reducirse. Detenga inmediatamente la digestión de la proteinasa K y deshidrate el portaobjetos sumergiéndolo en etanol al 70% durante 2 minutos, seguido de un tratamiento con etanol al 85% y al 100% durante 2 minutos cada uno. 3. FISH y la imagen Prepare la mezcla de hibridación FISH diluyendo 2 μL de caldo de sonda FISH con 8 μL de tampón de hibridación y, a continuación, aplíquelo al portaobjetos. Cubra la muestra con un cubreobjetos.NOTA: El material total de sondas FISH utilizado oscila entre 0,5 y 4 μL, dependiendo de la calidad de la imagen. Si la señal es demasiado baja, aumente la entrada de la sonda. Reduzca la entrada de la sonda FISH si el fondo es demasiado alto, especialmente cuando se observan residuos fluorescentes fuera de los núcleos. El tampón de hibridación puede ser el que se proporciona con las sondas compradas comercialmente o preparado como en la sección 1. Coloque los portaobjetos en una placa caliente, como un sistema de hibridación de foso de portaobjetos, para desnaturalizar el ADN a 75 °C durante 2-5 minutos. Luego, transfiera el portaobjetos a otra placa caliente configurada a 37 ° C para hibridar durante la noche.NOTA: Si la placa calefactora tiene una bandeja de agua o un depósito para mantener la humedad durante la hibridación, no es necesario sellar el cubreobjetos con cemento de caucho. Después de la hibridación, sumerja la corredera en 40-60 °C calentado 0.4x SSC con 0.3% de tampón de lavado IGEPAL CA-630, luego retire con cuidado el cubreobjetos. Continuar el lavado dos veces durante 5 minutos cada una en la oscuridad, con agitación durante los primeros 10-15 s.NOTA: Sumergir la corredera en el tampón de lavado ayuda a liberar suavemente el cubreobjetos. Lavar el portaobjetos en SSC con 0,1% IGEPAL CA-630 durante 5 min a RT en la oscuridad, con agitación durante los primeros 10-15 s. Para apagar la autofluorescencia, trate el portaobjetos con el kit de enfriamiento por autofluorescencia (consulte la tabla de materiales) aplicando 150 μL de reactivo (50 μL + 50 μL + 50 μL de reactivos A, B, C) durante 2-5 min, luego lávelo con 2x SSC durante 5 min.NOTA: Este es un paso opcional. La autofluorescencia tisular se origina principalmente a partir de componentes de la matriz extracelular, como el colágeno y la elastina. También está significativamente influenciado por los lisosomas y las mitocondrias debido a su contenido de lipofuscina, NADPH y flavina coenzima. La fijación de aldehídos y la presencia de células sanguíneas también pueden aumentar bien la autofluorescencia13,14. Tiñe el portaobjetos con DAPI durante 10 min. Enjuague el portaobjetos con 2 tampones SSC durante 5 min.NOTA: Si el portaobjetos no es tratado por el kit de enfriamiento de autofluorescencia, la tinción con DAPI se puede reducir a 2 min. Sumerja rápidamente el portaobjetos en agua desionizada durante no más de 1 s, luego séquelo rápidamente absorbiendo la humedad adicional con una toalla de papel.NOTA: Este es un paso opcional. El tratamiento con agua desionizada evita eficazmente la deposición de cristales de sal del tampón SSC en el portaobjetos y mejora la calidad de las imágenes. Sin embargo, en condiciones de iones tan bajos, los enlaces de hidrógeno entre la sonda FISH y el ADN objetivo se debilitan, lo que provoca la disociación de la sonda y la pérdida de señal. Por lo tanto, mantener la etapa de tratamiento del agua durante muy poco tiempo es crucial. Seque la corredera y, a continuación, móntela con un medio de montaje antidecoloración. Selle el cubreobjetos con esmalte de uñas antes de tomar imágenes.NOTA: Si el portaobjetos se trata con un reactivo de enfriamiento de autofluorescencia, monte el portaobjetos con un medio de montaje antidecoloración según las instrucciones del fabricante. Además, dependiendo del tipo de medio de montaje, endurecimiento o no endurecimiento, la muestra debe curarse durante 1-24 h antes del sellado y la obtención de imágenes. Se recomienda que la muestra se cure al menos durante la noche para lograr el mejor índice de refracción para la obtención de imágenes. Utilice una lente de aceite de 60× para capturar la señal de fluorescencia. Utilice el canal DAPI para ajustar el enfoque. Asegúrese de obtener varias pilas Z. Por lo general, 5-10 pilas z con un intervalo de 1 μm son suficientes. Realiza una proyección 3D máxima para conseguir la mejor resolución. Aplique deconvolución u otros algoritmos de borrado de fondo para mejorar aún más la calidad de la imagen.