Este protocolo proporciona un método reproducible para visualizar la amplificación de genes en muestras de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE).
La amplificación focal de genes, como el ADN extracromosómico (ADNec), desempeña un papel importante en el desarrollo del cáncer y la resistencia a la terapia. Si bien las metodologías basadas en la secuenciación permiten una identificación imparcial del ADNec, las técnicas basadas en citogenética, como la hibridación fluorescente in situ (FISH), siguen siendo rentables y siguen siendo rentables para identificar el ADNec en muestras clínicas. La aplicación de FISH en muestras de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE) ofrece una vía única para detectar genes amplificados, particularmente cuando no se dispone de muestras viables para el examen del cariotipo. Sin embargo, no hay procedimientos consensuados para esta técnica. Este protocolo proporciona instrucciones completas, totalmente optimizadas y paso a paso para realizar FISH con el fin de detectar la amplificación de genes, incluido el ADNec, en muestras de tejido FFPE que presentan desafíos únicos que este protocolo pretende superar y estandarizar. Siguiendo este protocolo, los investigadores pueden adquirir de forma reproducible datos de imagen de alta calidad para evaluar la amplificación génica.
El estudio de la amplificación de oncogenes focales es crucial, ya que impulsa la formación, progresión y resistencia al tratamientodel cáncer 1. Es importante destacar que los oncogenes y los genes inmunorreguladores pueden amplificarse como ADNec extracromosómicos (ADNec), cuya herencia asimétrica promueve la heterogeneidad genética en el cáncer 2,3. El ADNec se ha relacionado con la resistencia a la terapia y los resultados clínicos desfavorables 4,5,6.
Las muestras de tejido fijadas en formol e incluidas en parafina (FFPE) representan un vasto recurso de archivo en los laboratorios de patología, ya que ofrecen abundante información para estudios retrospectivos. Sin embargo, la extracción de datos moleculares de muestras de FFPE a través de PCR o secuenciación es un desafío debido a la fragmentación, degradación y reticulación de ácidos nucleicos durante la fijación7. Entre la gama de técnicas disponibles para el análisis molecular de tejidos FFPE, la hibridación fluorescente in situ (FISH) ha demostrado ser eficaz para visualizar secuencias específicas de ADN8.
A pesar del avance de las técnicas modernas de diagnóstico molecular, la capacidad de FISH para visualizar y cuantificar la amplificación génica a nivel de una sola célula proporciona información valiosa sobre los mecanismos moleculares que subyacen a la tumorigénesis y los resultados clínicos. Mediante el uso de sondas marcadas con fluorescencia complementarias al gen objetivo de interés, FISH puede resolver convenientemente la localización de un oncogén y puede inferir la forma de amplificación del oncogén (como el ecDNA) dentro de las células individuales, lo que de otro modo sería imposible o costoso a través de otras tecnologías. Por lo tanto, FISH ofrece una forma económica de evaluar la heterogeneidad tumoral y la evolución clonal9. Además, los avances en la automatización, la obtención de imágenes y el análisis computacional han facilitado el análisis de alto rendimiento de los datos FISH, lo que permite una cuantificación robusta de la amplificación génica en grandes cohortes de tejidos10.
Sin embargo, la aplicación de FISH al tejido FFPE presenta desafíos inherentes, incluidos los artefactos de reticulación y la autofluorescencia de fondo. La superación de estos obstáculos requiere una optimización cuidadosa de cada procedimiento para garantizar resultados precisos y reproducibles. Este documento proporciona un protocolo paso a paso totalmente optimizado para aplicar FISH para investigar la amplificación de genes en muestras de tejido FFPE. Utilizando una sonda dirigida al locus del gen ERBB2 (HER2), demostramos que FISH puede detectar de manera robusta el estado de amplificación de ERBB2 en muestras de FFPE de pacientes con cáncer de mama. Incluso es posible estimar si ERBB2 se amplifica como ADNec. Al sintetizar la literatura existente y nuestros hallazgos experimentales, dilucidamos las consideraciones metodológicas, los desafíos técnicos y las posibles trampas del análisis basado en FISH. También discutimos la relevancia clínica del perfil de amplificación génica en varios tipos de cáncer, destacando su importancia pronóstica y su potencial para estrategias terapéuticas personalizadas.
En resumen, este artículo subraya la importancia de FISH como una herramienta valiosa para estudiar la amplificación génica en muestras de tejido FFPE, ofreciendo información sin precedentes sobre la biología tumoral y guiando la toma de decisiones clínicas en oncología. Con el continuo refinamiento e integración con ensayos moleculares complementarios, el análisis basado en PET está preparado para mejorar aún más nuestra comprensión de la patogénesis del cáncer y mejorar los resultados de los pacientes en la era de la medicina de precisión.
FISH es una opción rápida y asequible para el diagnóstico citogenético. Especialmente para determinar si el ECDNA está presente en el cáncer, la evidencia de FISH sigue siendoel estándar de oro. La FISH en el tejido FFPE permite una rápida determinación del estado genético en las muestras de biopsia de un paciente, lo que permite un diagnóstico más rápido y un seguimiento de los cambios a lo largo del progreso de la enfermedad. Esta técnica es particularmente valiosa para analizar muestras clínicas que ya se han recolectado para patología.
Este protocolo implica varios pasos críticos. El primer paso es la desparafinación completa. La parafina residual puede interrumpir la hibridación de FISH. Si la muestra sigue pareciendo cerosa después del paso 2, debe tratarse de nuevo con xileno fresco o sus sustitutos.
En segundo lugar, la extracción y la digestión de proteínas son fundamentales. Estos procesos no solo mejoran la accesibilidad del ADN a la sonda FISH, sino que también reducen significativamente la autofluorescencia. Este protocolo incluye tres pasos de desproteinización. Si bien el tratamiento con HCl 0,2 N y ácido cítrico 10 mM es sencillo, la digestión de la proteinasa K puede requerir optimización. La digestión excesiva es el error más común cuando se usa proteinasa K, lo que resulta en núcleos en forma de halo. Acortar el tiempo de digestión mejorará la morfología de los núcleos. Además, se recomienda no digerir más de cuatro muestras simultáneamente para minimizar la diferencia de tiempo entre la primera y la última muestra. Es importante tener en cuenta que incluso un núcleo intacto puede aparecer como un halo bajo microscopía de gran aumento y alta resolución. Esto se debe a que el núcleo no está en el mismo plano focal. Por lo tanto, se sugiere tomar múltiples pilas Z y realizar una proyección máxima para inspeccionar la morfología nuclear.
Por último, se recomienda apagar la autofluorescencia. Aunque la extracción de ácido y la digestión de la proteinasa K pueden reducir significativamente el fondo derivado de proteínas, los metabolitos fluorescentes aún pueden afectar la calidad de la imagen.
Si bien FISH ofrece una resolución espacial sin precedentes en la identificación de la amplificación de genes focales, tiene limitaciones. En primer lugar, el contenido y el rendimiento son bajos en comparación con los enfoques basados en PCR o secuenciación de próxima generación (NGS). Por lo general, se pueden aplicar de una a tres sondas FISH de diferentes colores a un solo portaobjetos sin equipo especializado. No obstante, los avances en las tecnologías de automatización han hecho factibles los FISH de alto contenido y alto rendimiento, como la secuenciación in situ 21. En segundo lugar, el diseño de la sonda FISH requiere información previa. Los esfuerzos continuos para identificar eventos recurrentes de amplificación focal en el cáncer han permitido la creación de paneles FISH prediseñados para aplicaciones clínicas y de laboratorio. Por ejemplo, los oncogenes de la familia MYC se amplifican con frecuencia como ADNec en el cáncer de pulmón de células pequeñas para mediar la resistencia a la quimioterapia. Por lo tanto, un panel FISH dirigido a los genes MYC, MYCL y MYCN puede acelerar la determinación de las respuestas al tratamiento en las biopsias. En comparación, la NGS permite un cribado más imparcial de los genes de interés. Sin embargo, entre las tecnologías basadas en NGS, solo la secuenciación del genoma completo con un análisis costoso por cálculo22 puede caracterizar el ADNec.
En resumen, presentamos instrucciones sólidas y completas para investigar la amplificación focal de genes en muestras de FFPE. Al examinar el patrón de señal FISH, queda inequívocamente claro si un locus genético se amplifica y cómo. Anticipamos la integración del aprendizaje automático en el análisis de imágenes23 de núcleos de interfase para extraer información citogenética sobre el número de copias y la forma de amplificación (cromosoma o ecDNA), agilizando así el proceso de diagnóstico molecular y mejorando nuestra comprensión de los mecanismos patogenéticos en el cáncer.
The authors have nothing to disclose.
S.W. es un erudito y cuenta con el apoyo del Instituto de Investigación y Prevención del Cáncer de Texas (RR210034)
DAPI | Tocris Bioscience | 5748 | Nucleus staining |
Dextran sulfate 50% solution | EMD Millipore Sigma | S4030 | Probe hybridization buffer |
ERBB2 (HER2) FISH Probe | Empire Genomics | ERBB2-20-RE | FISH probe |
Ethanol | Decon Labs | 2716 | Dehydrating and hydrating tissue |
Formamide | Thermo Scientific Chemicals | 205821000 | Probe hybridization buffer |
Formula 83 (Xylene substitute) | CBG Biotech | CH0104A | Removing paraffin |
Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | Sample pretreatment |
IGEPAL CA-630 | Thermo Scientific Chemicals | J19628K2 | Slide washing |
Proclin 300 | Sigma-Aldrich | 48914-U | Preservative for SSC buffer (optional) |
Proteinase K (800 units/mL) | New England Biolabs | P8107S | Protein digestion |
RNase A (20 mg/mL) | New England Biolabs | T3018L | Probe hybridization buffer |
Slide Moat Hybridization System | Boekel Scientific | 280001 | Sample denature and hybridization. Alternative hot plates are acceptable. |
Sodium chloride | Fisher Chemical | S2713 | SSC buffer |
Sodium citrate dihydrate | Fisher BioReagents | FLBP3271 | SSC buffer and sample pretreatment |
Tris-EDTA (TE) buffer | Fisher BioReagents | BP2473500 | Proteinase K digestion buffer |
Tween-20 | Fisher BioReagents | BP337-500 | Probe hybridization buffer |
Vectashield antifade mounting media | Vector Laboratories | H190010 | Slide mounting |
Vector TrueVIEW | Vector Laboratories | SP8400 | Autofluorescence quenching kit |
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