זיהוי חזק של הגברה גנטית בדגימות משובצות פרפין קבועות פורמלין על ידי הכלאה פלואורסצנטית באתרו

פרוטוקול מחקר זה אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית (IRB) של המרכז הרפואי של אוניברסיטת טקסס סאות’ווסטרן. הסכמה מדעת התקבלה מכל המטופלים לפני הניתוח. 1. ריאגנטים והכנת חומרים הכינו את תמיסת הנתרן כלורי 0.2 N (HCl) במנדף על ידי הוספה איטית של 8.212 מ”ל HCl (37% w/w או 12.1 N) ל-491.788 מ”ל של ddH2O. יש לאחסן בטמפרטורת החדר (RT).אזהרה: הוסיפו חומצה למים באיטיות. אין להוסיף מים לחומצה. הכן תמיסת חומצת לימון 10 mM (pH 6.0) על ידי המסת 1.47 גרם של Tri-sodium ציטראט (דיהידראט) ב 400 מ”ל של ddH2O. השתמש HCl כדי להתאים ל- pH 6.0, ולאחר מכן להביא את הנפח הסופי ל 500 מ”ל עם ddH2O. אחסן את המאגר ב- RT. הכן את תמיסת 10% Tween-20 על ידי הוספת 100 μL של Tween-20 עד 900 μL של ddH2O. אחסן אותה ב- RT. הכן את פתרון IGEPAL 10% על ידי הוספת 5 מ”ל של IGEPAL CA-630 ל 45 מ”ל של ddH2O. אחסן אותו ב- RT. הכן את תמיסת SSC 20x (pH 7.0, 3 M NaCl, 0.3 M נתרן ציטראט) על ידי המסת 44.1 גרם של Tri-sodium ציטראט (דיהידראט) ו- 87.65 גרם נתרן כלורי (NaCl) ב- 900 מ”ל של ddH2O. השתמש ב- HCl כדי להתאים ל- pH 7.0, ולאחר מכן הבא את הנפח הסופי ל- 1000 מ”ל עם ddH2O. אחסן את המאגר ב- RT. הכן את פתרון SSC 2x על ידי הוספת 100 מ”ל של 20x SSC ל- 900 מ”ל של ddH2O. במידת הצורך, להוסיף 0.5 מ”ל של חומר משמר (טבלה של חומרים). אחסן אותו ב- RT. הכן את מאגר הכלאת הבדיקה על ידי ערבוב 910 μL של ddH2O, 500 μL של 20x SSC, 50 μL של 10% Tween-20, 40 μL של RNase A, 1 מ”ל של 50% דקסטרן סולפט, ו 2.5 מ”ל של פורממיד. Aliquot לתוך 1 מ”ל ולאחסן אותם ב -20 ° C. הכן את ה- SSC 0.4x עם תמיסת IGEPAL 0.3% על ידי ערבוב 100 מ”ל של 2x SSC, 15 מ”ל של 10% IGEPAL ו- 385 מ”ל של ddH2O. אחסן אותו ב- RT. הכן את 2x SSC עם פתרון IGEPAL 0.1% על ידי הוספת 5 מ”ל של 10% IGEPAL ל 495 מ”ל של 2x פתרון SSC. אחסן אותו ב- RT. יש להכין את מאגר העיכול Proteinase K לפני השימוש על ידי הוספת 1 μL של Proteinase K ל-99 μL של מאגר Tris-EDTA. הכן מלאי אחסון DAPI של 1 מ”ג/מ”ל על-ידי המסת 1 מ”ג של DAPI ב-1 מ”ל של ddH2O. אחסן אותו בטמפרטורה של -20°C והרחק מאור. הכן את פתרון העבודה של DAPI על-ידי הוספת 1 μL ממלאי האחסון של DAPI ל- 999 μL של תמיסת SSC כפולה. יש להרחיק מאור עד לשימוש. 2. טיפול מקדים לדוגמה הערה: השקופית המשמשת כאן מכילה את הדגימה. התיישן את המגלשה בטמפרטורה של 60-90 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות או למשך הלילה (איור 1).הערה: שלב זה מקל על המסת פרפין. בדרך כלל, 20 דקות של חימום מספיק. ניתן להאריך אותו למשך לילה כדי להתאים ללוח הזמנים. נטרלו את המגלשה על ידי טבילתה בקסילן או בתחליפיו בצנצנת קופלין למשך 10 דקות. חזור על שלב זה עם קסילן טרי או תחליפים. בצעו את כל השלבים הבאים של טיפול מקדים ושטיפה בצנצנת קופלין.הערה: תחליפי קסילן הם חלופות בטוחות וידידותיות לסביבה לקסילן. אחד התחליפים (ראה טבלת חומרים) מתפקד טוב כמו קסילן, אם לא טוב יותר. למרות שתחליפי קסילן מייצרים פחות ריח מאשר קסילן, מומלץ להשתמש בהם בתוך מכסה אדים. אם תחליפי קסילן אינם נגישים, כל ההליכים תואמים לדפרפיניזציה מבוססת קסילן ללא שינויים. שטפו את תחליף הקסילן באתנול 100% למשך 5 דקות. יש לייבש את המגלשה עם טבילה של אתנול 70% למשך 5 דקות. טבלו את המגלשה לתוך 0.2 N חומצה הידרוכלורית (HCl) ב-RT למשך 20 דקות.הערה: HCl מחלץ ביעילות חלבונים מסיסים בחומצה, כגון חלבונים גרעיניים בסיסיים, כדי לשפר את נגישות הדנ”א לבדיקות FISH11. יש לטבול את המגלשה בתמיסת חומצת לימון חמה בעומק 10 מ”מ ולדגור בטמפרטורה של 90-95 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.הערה: טיפול בחומצת לימון בטמפרטורות גבוהות מחלץ באופן דומה חלבונים מסיסים בחומצה. שני טיפולי החומצה נחשבים לחלץ חלבוני מטריצה חוץ-תאיים כדי להפחית אוטופלואורסצנטיות12. מומלץ לחמם מראש את תמיסת הלימון לטווח הטמפרטורות הרצוי לפני החלתה על המגלשה. מיקרוגל יכול להיות דרך נוחה לעשות זאת. אמבט מים, כמו למשל עם סיר סו-ויד, הוא הפתרון היעיל והחסכוני ביותר לדגירת טמפרטורה גבוהה. שטפו את השקופית לזמן קצר ב-2x SSC כדי לנטרל pH. לעכל את הרקמה על ידי הוספת 100-200 μL (מספיק כדי לכסות לחלוטין את הרקמה בהתאם לגודל של קטע) של Proteinase K digestion buffer ולדגור ב RT במשך 1 דקות.הערה: עיכול פרוטאינאז K מגביר עוד יותר את הנגישות לבדיקות FISH ומפחית אוטופלואורסצנציה. זמן העיכול צריך להיות אופטימלי על בסיס סוגי הרקמות. ברוב המקרים, 1 דקה של עיכול מספיק. עיכול יתר מוביל למורפולוגיה של גרעינים בצורת הילה, ויש לקצר את זמן העיכול. להפסיק מיד את העיכול Proteinase K ולייבש את המגלשה על ידי טבילתו לתוך אתנול 70% במשך 2 דקות, ולאחר מכן טיפול 85% ו 100% אתנול במשך 2 דקות כל אחד. 3. דגים והדמיה הכינו את תערובת ההכלאה של FISH על ידי דילול 2 μL של מלאי בדיקות FISH עם 8 μL של מאגר הכלאה, ולאחר מכן מרחו אותו על השקופית. כסו את הדגימה בתלוש כיסוי.הערה: מלאי בדיקות FISH הכולל בשימוש נע בין 0.5-4 μL, בהתאם לאיכות התמונה. אם האות נמוך מדי, הגדל את קלט הבדיקה. הפחיתו את קלט הבדיקה FISH אם הרקע גבוה מדי, במיוחד כאשר נצפתה פסולת פלואורסצנטית מחוץ לגרעינים. חיץ ההכלאה יכול להיות זה המסופק עם הגשושיות שנרכשו מסחרית או מוכן כמו בסעיף 1. הניחו את המגלשות על פלטה חשמלית, כגון מערכת הכלאה של חפיר שקופיות, כדי לפרק DNA בטמפרטורה של 75°C למשך 2-5 דקות. לאחר מכן, העבירו את המגלשה לפלטה חמה אחרת בטמפרטורה של 37°C כדי לבצע הכלאה למשך הלילה.הערה: אם בפלטה החמה יש מגש מים או מיכל מים כדי לשמור על הלחות במהלך הכלאה, אין צורך באיטום הכיסוי במלט גומי. לאחר הכלאה, יש לטבול את המגלשה בטמפרטורה של 40-60 מעלות צלזיוס עם 0.4x SSC מחומם עם חיץ כביסה IGEPAL CA-630 0.3%, ולאחר מכן להסיר בזהירות את הכיסוי. ממשיכים את הכביסה פעמיים במשך 5 דקות כל אחד בחושך, עם תסיסה במשך 10-15 שניות ראשונות.הערה: טבילת המגלשה במאגר הכביסה מסייעת לשחרר בעדינות את הכיסוי. שטפו את המגלשה ב-SSC עם 0.1% IGEPAL CA-630 למשך 5 דקות ב-RT בחושך, עם תסיסה במשך 10-15 השניות הראשונות. כדי להרוות אוטופלואורסצנטיות, טפל בשקופית עם ערכת המרווה האוטופלואורסצנטית (ראה טבלת חומרים) על ידי מריחת 150 μL של מגיב (50 μL + 50 μL של ריאגנטים A, B, C) למשך 2-5 דקות, ולאחר מכן שטוף אותו עם 2x SSC במשך 5 דקות.הערה: זהו שלב אופציונלי. אוטופלואורסצנטיות רקמות מקורה בעיקר ברכיבי מטריצה חוץ-תאיים, כגון קולגן ואלסטין. הוא גם מושפע באופן משמעותי מליזוזומים ולמיטוכונדריה, בזכות תכולת הליפופוצין, NADPH וקו-אנזים הפלבין שלהם. קיבוע אלדהיד ונוכחות תאי דם עשויים גם להגביר את האוטופלואורסצנטיות היטב13,14. הכתימו את המגלשה עם DAPI למשך 10 דקות. שטפו את המגלשה עם 2x SSC buffer במשך 5 דקות.הערה: אם השקופית אינה מטופלת על ידי ערכת המרווה האוטופלואורסצנטית, ניתן להפחית את צביעת DAPI לשתי דקות. טבלו במהירות את המגלשה במים נטולי יונים, למשך לא יותר משנייה אחת, ולאחר מכן יבשו אותה במהירות על ידי ספיגת לחות נוספת עם מגבת נייר.הערה: זהו שלב אופציונלי. טיפול במים שעברו דה-יוניזציה מונע ביעילות שקיעת גבישי מלח של חיץ SSC במגלשה ומשפר את איכות ההדמיה. עם זאת, בתנאי יונים נמוכים כאלה, קשרי המימן בין הגשושית FISH לבין דנ”א ממוקד נחלשים, מה שמוביל לדיסוציאציה של הגשושית ולאובדן אותות. לכן, שמירה על שלב הטיפול במים לזמן קצר מאוד היא קריטית. יבש את המגלשה ולאחר מכן טען אותה עם אמצעי הרכבה נגד דהייה. יש לאטום את הכיסוי בלק לפני ההדמיה.הערה: אם השקופית מטופלת על-ידי מגיב מרווה אוטופלואורסצנטי, טען את השקופית עם אמצעי הרכבה נגד דעיכה בהתאם להוראת היצרן. יתר על כן, בהתאם לסוג של מדיה הרכבה, התקשות או לא התקשות, הדגימה חייבת להירפא במשך 1-24 שעות לפני איטום והדמיה. מומלץ לרפא את הדגימה לפחות בן לילה כדי להשיג את מדד השבירה הטוב ביותר להדמיה. השתמש בעדשת שמן 60× כדי ללכוד אות פלואורסצנטי. השתמש בערוץ DAPI כדי לכוונן את המיקוד. הקפד להשיג ערימות Z מרובות. בדרך כלל, 5-10 z-stacks עם מרווח של 1 מיקרומטר מספיקים. בצע הקרנה תלת-ממדית מרבית כדי להשיג את הרזולוציה הטובה ביותר. החל deconvolution או אלגוריתמים אחרים לניקוי רקע כדי לשפר עוד יותר את איכות התמונה.