Этот протокол представляет собой воспроизводимый метод визуализации амплификации генов в образцах тканей, встроенных в парафин с фиксированным формалином (FFPE).
Фокальная амплификация генов, таких как экстрахромосомная ДНК (экДНК), играет важную роль в развитии рака и резистентности к терапии. В то время как методологии, основанные на секвенировании, позволяют объективно идентифицировать экДНК, цитогенетические методы, такие как флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), остаются эффективными с точки зрения времени и затрат для идентификации экДНК в клинических образцах. Применение FISH в образцах тканей, залитых формалином и парафином (FFPE), открывает уникальные возможности для обнаружения амплифицированных генов, особенно в тех случаях, когда жизнеспособные образцы недоступны для исследования кариотипа. Тем не менее, существует отсутствие согласованных процедур для этой техники. Этот протокол содержит исчерпывающие, полностью оптимизированные, пошаговые инструкции по проведению FISH для обнаружения амплификации генов, включая экДНК, в образцах тканей FFPE, которые представляют собой уникальные проблемы, которые данный протокол призван преодолеть и стандартизировать. Следуя этому протоколу, исследователи могут воспроизводимо получать высококачественные данные визуализации для оценки амплификации генов.
Изучение амплификации фокальных онкогенов имеет решающее значение, поскольку она стимулирует образование, прогрессирование рака и резистентность к терапии1. Важно отметить, что онкогены и иммунорегуляторные гены могут амплифицироваться в виде внехромосомных ДНК (экДНК), асимметричное наследование которых способствует генетической гетерогенности при раке 2,3. экДНК была связана с резистентностью к терапии и неблагоприятными клиническими исходами 4,5,6.
Образцы тканей, интегрированные формалином в парафин (FFPE), представляют собой обширный архивный ресурс в лабораториях патологии, предлагая обильную информацию для ретроспективных исследований. Тем не менее, извлечение молекулярных данных из образцов FFPE с помощью ПЦР или секвенирования является сложной задачей из-за фрагментации, деградации и сшивания нуклеиновых кислот во время фиксации7. Среди множества методов, доступных для молекулярного анализа тканей FFPE, флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) доказала свою эффективность для визуализации конкретных последовательностей ДНК8.
Несмотря на развитие современных методов молекулярной диагностики, способность FISH визуализировать и количественно оценивать амплификацию генов на уровне отдельных клеток дает ценную информацию о молекулярных механизмах, лежащих в основе онкогенеза и клинических исходов. Используя флуоресцентно меченые зонды, комплементарные интересующему гену-мишени, FISH может удобно разрешить локализацию онкогена и может сделать вывод о форме амплификации онкогена (например, экДНК) в отдельных клетках, что в противном случае невозможно или дорого при использовании других технологий. Таким образом, FISH предлагает экономичный способ оценки гетерогенности опухоли и клональной эволюции9. Кроме того, достижения в области автоматизации, визуализации и вычислительного анализа облегчили высокопроизводительный анализ данных FISH, что позволило провести надежную количественную оценку амплификации генов в больших тканевых когортах.
Тем не менее, применение FISH к тканям FFPE сопряжено с неотъемлемыми трудностями, включая артефакты поперечного сшивания и фоновую автофлуоресценцию. Преодоление этих препятствий требует тщательной оптимизации каждой процедуры для обеспечения точных и воспроизводимых результатов. В этой статье представлен пошаговый, полностью оптимизированный протокол применения FISH для исследования амплификации генов в образцах тканей FFPE. Используя зонд, нацеленный на локус гена ERBB2 (HER2), мы демонстрируем, что FISH может надежно обнаруживать статус амплификации ERBB2 в образцах FFPE у пациентов с раком молочной железы. Можно даже оценить, амплифицируется ли ERBB2 в виде экДНК. Синтезируя существующую литературу и наши экспериментальные результаты, мы проливаем свет на методологические соображения, технические проблемы и потенциальные подводные камни анализа на основе FISH. Мы также обсуждаем клиническую значимость профилирования амплификации генов при различных типах рака, подчеркивая его прогностическую значимость и потенциал для персонализированных терапевтических стратегий.
Подводя итог, можно сказать, что в этой статье подчеркивается важность FISH как ценного инструмента для изучения амплификации генов в образцах тканей FFPE, предлагающего беспрецедентное понимание биологии опухоли и направляющего для принятия клинических решений в онкологии. Благодаря постоянному совершенствованию и интеграции с комплементарными молекулярными анализами, анализ на основе FISH готов еще больше углубить наше понимание патогенеза рака и улучшить результаты лечения пациентов в эпоху точной медицины.
FISH – это быстрый и доступный вариант цитогенетической диагностики. Особенно при определении того, присутствует ли экДНК при раке, доказательства FISH остаются золотымстандартом. FISH в тканях FFPE позволяет быстро определить статус гена в образцах биопсии пациента, что позволяет быстрее диагностировать и отслеживать изменения на протяжении всего течения заболевания. Эта методика особенно ценна для тестирования клинических образцов, которые уже были собраны на патологию.
Этот протокол включает в себя несколько важных этапов. Первым этапом является тщательная депарафинизация. Остаточный парафин может нарушить гибридизацию FISH. Если после этапа 2 образец по-прежнему выглядит восковым, его следует снова обработать свежим ксилолом или его заменителями.
Во-вторых, извлечение и переваривание белка имеют решающее значение. Эти процессы не только повышают доступность ДНК к FISH-зонду, но и значительно снижают автофлуоресценцию. Этот протокол включает в себя три этапа депротеинизации. В то время как лечение 0,2 N HCl и 10 мМ лимонной кислотой является простым, расщепление протеиназы К может потребовать оптимизации. Переваривание является наиболее распространенной ошибкой при использовании протеинады К, приводящей к образованию галообразных ядер. Сокращение времени переваривания улучшит морфологию ядер. Кроме того, рекомендуется не переваривать более четырех образцов одновременно, чтобы свести к минимуму разницу во времени между первым и последним образцом. Важно отметить, что даже неповрежденное ядро может выглядеть как ореол при большом увеличении и микроскопии с высоким разрешением. Это связано с тем, что ядро не находится в одной фокальной плоскости. Поэтому предлагается взять несколько Z-стеков и выполнить максимальную проекцию для изучения морфологии ядра.
Наконец, рекомендуется гашение автофлуоресценции. Несмотря на то, что экстракция кислотой и расщепление протеиназы К могут значительно снизить фон белка, флуоресцентные метаболиты все же могут влиять на качество визуализации.
Несмотря на то, что FISH предлагает беспрецедентное пространственное разрешение для идентификации фокальной амплификации генов, у него есть ограничения. Во-первых, содержание и производительность являются низкими по сравнению с подходами, основанными на ПЦР или секвенировании нового поколения (NGS). Как правило, от одного до трех FISH-зондов разных цветов могут быть нанесены на одно предметное стекло без специального оборудования. Тем не менее, достижения в области технологий автоматизации сделали возможным использование FISH с высоким содержанием и высокой пропускной способностью, например, секвенирование in situ 21. Во-вторых, конструкция FISH-зонда требует предварительной информации. Продолжающиеся усилия по выявлению повторяющихся событий фокальной амплификации при раке позволили создать предварительно разработанные панели FISH для лабораторного и клинического применения. Например, онкогены семейства MYC часто амплифицируются в виде экДНК при мелкоклеточном раке легкого для опосредования резистентности к химиотерапии. Таким образом, панель FISH, нацеленная на гены MYC, MYCL и MYCN, может ускорить определение ответов на лечение в биопсии. Для сравнения, NGS позволяет проводить более объективный скрининг генов, представляющих интерес. Однако среди технологий, основанных на NGS, только полногеномное секвенирование с ресурсоемким анализом22 может охарактеризовать экДНК.
Таким образом, мы представляем надежные и исчерпывающие инструкции по исследованию фокальной амплификации генов в образцах FFPE. Изучая паттерн сигнала FISH, становится однозначно ясно, усиливается ли локус гена и каким образом. Мы ожидаем интеграции машинного обучения в анализ изображений23 интерфазных ядер для извлечения цитогенетической информации о количестве копий и форме амплификации (хромосоме или экДНК), тем самым оптимизируя процесс молекулярной диагностики и улучшая наше понимание патогенетических механизмов при раке.
The authors have nothing to disclose.
С.В. является научным сотрудником и получает поддержку Техасского института профилактики и исследований рака (RR210034)
DAPI | Tocris Bioscience | 5748 | Nucleus staining |
Dextran sulfate 50% solution | EMD Millipore Sigma | S4030 | Probe hybridization buffer |
ERBB2 (HER2) FISH Probe | Empire Genomics | ERBB2-20-RE | FISH probe |
Ethanol | Decon Labs | 2716 | Dehydrating and hydrating tissue |
Formamide | Thermo Scientific Chemicals | 205821000 | Probe hybridization buffer |
Formula 83 (Xylene substitute) | CBG Biotech | CH0104A | Removing paraffin |
Hydrochloric acid | Fisher Chemical | A144-500 | Sample pretreatment |
IGEPAL CA-630 | Thermo Scientific Chemicals | J19628K2 | Slide washing |
Proclin 300 | Sigma-Aldrich | 48914-U | Preservative for SSC buffer (optional) |
Proteinase K (800 units/mL) | New England Biolabs | P8107S | Protein digestion |
RNase A (20 mg/mL) | New England Biolabs | T3018L | Probe hybridization buffer |
Slide Moat Hybridization System | Boekel Scientific | 280001 | Sample denature and hybridization. Alternative hot plates are acceptable. |
Sodium chloride | Fisher Chemical | S2713 | SSC buffer |
Sodium citrate dihydrate | Fisher BioReagents | FLBP3271 | SSC buffer and sample pretreatment |
Tris-EDTA (TE) buffer | Fisher BioReagents | BP2473500 | Proteinase K digestion buffer |
Tween-20 | Fisher BioReagents | BP337-500 | Probe hybridization buffer |
Vectashield antifade mounting media | Vector Laboratories | H190010 | Slide mounting |
Vector TrueVIEW | Vector Laboratories | SP8400 | Autofluorescence quenching kit |
.