כימות הרמה של 8-oxo-dG באמצעות בדיקת ELISA להערכת נזק חמצוני לדנ"א בתאי MCF-7
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לגילוי כמותי של נזקי חמצון בתאי MCF-7 בטכנולוגיית ELISA.
Abstract
בסיס 8-Oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine (8-oxo-dG) הוא הצורה השלטת של נזק חמצוני DNA נפוץ. פגיעה בדנ”א משפיעה עמוקות על ביטוי גנים ומשמשת גורם מרכזי בגירוי הפרעות נוירודגנרטיביות, סרטן והזדקנות. לכן, לכימות מדויק של 8-oxoG יש משמעות קלינית בחקירת מתודולוגיות זיהוי נזקי DNA. עם זאת, כיום, הגישות הקיימות לזיהוי 8-oxoG מציבות אתגרים במונחים של נוחות, תועלתיות, מחיר סביר ורגישות מוגברת. השתמשנו בטכניקת ELISA (Marketing), שיטה קולורימטרית יעילה ומהירה ביותר, כדי לזהות שינויים בתכולת 8-oxo-dG בדגימות תאים MCF-7 שעוררו בריכוזים שונים של מי חמצן (H2O2). קבענו את הריכוז של H2O2 שגרם לנזק חמצוני בתאי MCF-7 על ידי זיהוי ערך IC50 שלו בתאי MCF-7. לאחר מכן, טיפלנו בתאי MCF-7 עם 0, 0.25 ו-0.75 mM H2O2 במשך 12 שעות וחילצנו 8-oxo-dG מהתאים. לבסוף, הדגימות היו חשופות ELISA. לאחר סדרה של שלבים, כולל פיזור לוחות, שטיפה, דגירה, התפתחות צבע, סיום התגובה ואיסוף נתונים, זיהינו בהצלחה שינויים בתכולת 8-oxo-dG בתאי MCF-7 המושרים על ידי H2O2. באמצעות מאמצים כאלה, אנו שואפים לבסס שיטה להערכת מידת הנזק החמצוני של דנ”א בתוך דגימות תאים, ובכך לקדם את הפיתוח של גישות יעילות ונוחות יותר לזיהוי נזק לדנ”א. מאמץ זה צפוי לתרום תרומה משמעותית לחקר ניתוחים אסוציאטיביים בין נזק חמצוני לדנ”א לבין תחומים שונים, כולל מחקר קליני על מחלות ואיתור חומרים רעילים.
Introduction
נזק חמצוני לדנ”א הוא תוצאה של חוסר איזון בין יצירת מיני חמצן תגובתי (ROS) לבין מערכת ההגנה נוגדת החמצון התאית1. זה בעיקר כרוך חמצון של DNA purine ו pyrimidine בסיסים 2,3. שינוי חמצוני זה של בסיסי דנ”א לא רק פוגע בשלמות הגנום, אלא גם מקיף מגוון רחב של בעיות פתולוגיות, כולל סרטן, מחלות נוירודגנרטיביות ומחלות לב וכלי דם 4,5. בסיס הגואנין בדנ”א הוא בעל פוטנציאל החיזור הנמוך ביותר והוא הרגיש ביותר לחמצון6. לכן, 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine (8-oxo-dG) משמש כסמן עיקרי להערכת מידת הנזק החמצוני לדנ”א 7,8. הכימות המדויק של 8-oxo-dG הפך לנושא קריטי בטיפול בהיבטים שונים של הופעת מחלות, התקדמות והערכת נטל חמצון רב-גורמי9.
השיטות המסורתיות לגילוי 8-oxo-dG, כגון כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים עם זיהוי אלקטרוכימי (HPLC-ECD), ספקטרומטריית מסות וטכניקות מיקוף קשורות, מציגות רגישות גבוהה וספציפיות 10,11,12. עם זאת, טכניקות אלה לעתים קרובות יש דרישות תפעוליות מורכבות ועלויות גבוהות, אשר מעכבים את היישום הנרחב שלהם ואת המעשיות בניתוח מדגם תפוקה גבוהה. עם ההתקדמות המתמדת של המדע והטכנולוגיה, התפתחו מגוון שיטות חדשות, יעילות ומדויקות. היישום של טכנולוגיות חדשות אלה מאפשר לנו לכמת את רמת 8-oxo-dG בצורה מדויקת יותר ומספק כלים חזקים יותר למחקר מעמיק של הקשר בין עקה חמצונית ומחלות. לדוגמה, חוקרים יישמו טכנולוגיית ננו-נקבוביות כדי לזהות ולרצף כמותית DNA13, לזהות סוגי נזק לדנ”א באמצעות אסטרטגיית ריצוף קוד14 בלחיצה אחת, לפתח שיטות ריצוף בתפוקה גבוהה וליצור ביו-חיישנים מבוססי 8-oxoG על ידי שילוב ביוטין-סטרפטאבידין עם ELISA15. ביניהם, ELISA, עם היתרונות המוכרים שלה במונחים של ספציפיות, סינון תפוקה גבוהה, ועלות, הוא אחד הפתרונות האידיאליים עבור זיהוי 8-oxo-dG. לכן, חיוני לפתח שיטה בעלת תפוקה גבוהה, רגישה מאוד, נוחה ומהירה לזיהוי 8-oxo-dG.
טכניקת בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA), שפותחה בשנת 197116, התקדמה במהירות במהלך 50 השנים האחרונות והפכה כעת לאחת משיטות הזיהוי הנפוצות ביותר בתחומי הביולוגיה והרפואה 17,18,19. טכנולוגיית ELISA מפגינה רגישות וספציפיות גבוהות, בעלת זמן תגובה קצר וקלה לשימוש, מה שהופך אותה לבחירה מוכרת עבור בדיקות דגימה בקנה מידה גדול וניתוח תפוקה גבוהה20. כתוצאה מכך, ELISA נמצא בשימוש נרחב לניתוח כמותי או כמותי למחצה של תרכובות, חלבונים, נוגדנים או מולקולות בתוך תאים 21,22,23. לדוגמה, נעשה בו שימוש בזיהוי סמנים ביולוגיים הקשורים למחלות שונות, שאריות תרופות וביומולקולות24. ניתן לסווג את ELISAs לארבעה סוגים עיקריים בהתבסס על תכנון ניסויי ועקרונות25. שיטות אלה כוללות ELISA ישיר, ELISA עקיף, סנדוויץ’ ELISAותחרותי ELISA 26,27. מבין אלה, סנדוויץ’ ELISA, המשתמש בשני נוגדנים ספציפיים, אחד ללכידת מולקולת המטרה והשני לזיהוי, נבחר למחקר במאמר זה. העיקרון הניסיוני של סנדוויץ ‘ELISA הוא כדלקמן: ראשית, נוגדן מסוים משותק בבארות של microplate כדי ללכוד את הניתוח של עניין. לאחר הוספת התקן או הדגימה, ניתוח המטרה נקשר לנוגדן המשותק. לאחר מכן, נוגדן מסומן המזהה אפיטופ שונה על האנטיגן מתווסף, ויוצר מבנה כריך. לאחר הסרת נוגדנים לא קשורים, מתווסף מצע. תחת הפעולה הקטליטית של הנוגדן המשני, מתרחשת תגובת צבע, ועוצמת הצבע מתואמת באופן חיובי עם ריכוז המטרה האנליטית בדגימה. לבסוף, הצפיפות האופטית (OD) נמדדה כדי לקבוע את ריכוז הדגימה. לסנדוויץ’ ELISA יתרונות של רגישות מוגברת וספציפיות לדגימות מטרה, מה שהופך אותו מתאים לאיתור ריכוזים נמוכים של אנליטות מטרה ודגימות מורכבות28. בנוסף, ניתן לכמת את התוצאות המתקבלות לניתוח נוסף. גורמים אלה הופכים את סנדוויץ’ ELISA לשיטת זיהוי נפוצה הן במחקר מדעי והן במעבדות קליניות29.
מחקר זה נועד לזהות כמותית 8-oxo-dG בתאי MCF-7 כדי לקבוע את מידת הנזק החמצוני לדנ”א בתאים. מחקר זה מורכב משני חלקים עיקריים: בניית מודל נזק חמצוני לדנ”א תאי MCF-7 וגילוי 8-oxo-dG באמצעות ELISA. ראשית, תאי MCF-7 גודלו בתרבית חוץ גופית וטופלו בריכוזים שונים של H2O2 לפרקי זמן שונים. כדאיות התא הוערכה באמצעות בדיקת CCK-8 כדי לקבוע את ריכוז המעכב החצי מקסימלי (IC50) של H2O2 בתאי MCF-7. בהתבסס על ערכי IC50 , נבחרו זמן טיפול H2O2 מתאים וריכוז אינדוקציה. כדי לחלץ דגימות של תאי MCF-7 שניזוקו על ידי חמצון, דגימות תאים וסופרנאטנטים התקבלו ונוספו לבארות מקושרות אנזימים שצופו בעבר בנוגדנים 8-oxo-dG. 8-oxo-dG הקיים בדגימה ייקשר לנוגדנים הקשורים לנשא השלב המוצק. לאחר מכן, נוספו נוגדנים 8-oxo-dG המסומנים בפרוקסידז חזרת. תערובת התגובה הודגרה בטמפרטורה קבועה כדי להבטיח קשירה מלאה של הדגימה והנוגדן. האנזים הלא קשור הוסר על ידי שטיפה, ואז נוסף המצע הקולרימטרי, שהפיק צבע כחול. תחת פעולה של חומצה, הפתרון הפך צהוב. לבסוף, ערך OD של דגימות באר התגובה נמדד ב 450 ננומטר, והריכוז של 8-oxo-dG בדגימה היה פרופורציונלי לערך OD. על ידי יצירת עקומה סטנדרטית, ניתן לחשב את הריכוז של 8-oxo-dG במדגם.
Protocol
Representative Results
Discussion
לפיתוח שיטות ELISA חשיבות רבה עבור מתודולוגיות קיימות וחדשות לזיהוי נזקי DNA. בהשוואה לטכניקות HPLC מסורתיות וספקטרומטריית מסות, גישה זו לא רק ידידותית למשתמש אלא גם מפגינה רגישות גבוהה ועונה על הדרישות של סינוןבתפוקה גבוהה 30. זה מאפשר ניטור של 8-oxo-dG במחקרי סינון מחלות בקנה מידה גד?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי צוות המחקר החדשני של מכון ג’יאנגסו להשכלה גבוהה למדע וטכנולוגיה (2021), תוכנית מרכז המחקר הטכנולוגי ההנדסי של המכללה המקצועית ג’יאנגסו (2023), תוכנית טכנולוגית מפתח של פרויקטים טכנולוגיים לפרנסת אנשי סוג’ואו (SKY2021029), פרויקט פתוח של ג’יאנגסו ביובנק למשאבים קליניים (TC2021B009), פרויקט מעבדת מפתח המדינה לרפואת קרינה והגנה, אוניברסיטת סוצ’ו (GZK12023013), תוכניות של המכללה לבריאות מקצועית סוג’ואו (SZWZYTD202201), ופרויקט צ’ינג-לאן של מחוז ג’יאנגסו בסין (2021, 2022).
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA(1x) | Gibco | 25200-072 | |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo | CK04 | |
| Cell Counting Plate | QiuJing | XB-K-25 | |
| CO2 incubator | Thermo | 51032872 | |
| DMEM basic(1X) | Gibco | C11995500BT | |
| FBS | PAN | ST30-3302 | |
| GraphPad Prism X9 | GraphPad Software | statistical analysis software | |
| H2O2(3%) | Jiangxi Caoshanhu Disinfection Co.,Ltd. | 1028348 | |
| high-speed centrifuge | Thermo | 9AQ2861 | |
| Human 8-oxo-dG ELISA Kit | Zcibio | ZC-55410 | |
| L-1000XLS+ Pipettes | Rainin | 17014382 | |
| L-20XLS+ Pipettes | Rainin | 17014392 | |
| liquid nitrogen tank | Mvecryoge | YDS-175-216 | |
| MCF-7 CELL | BNCC | BNCC100137 | |
| Multiskan FC microplate photometer | Thermo | 1410101 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Beyotime | C0222 | |
| Trinocular live cell microscope | Motic | 1.1001E+12 | |
| Ultra-low temperature freezer | Haire | V118574 |
References
- Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: Mechanisms, mutation, and disease. Faseb J. 17 (10), 1195-1214 (2003).
- Dizdaroglu, M., Jaruga, P. Mechanisms of free radical-induced damage to DNA. Free Radic Res. 46 (4), 382-419 (2012).
- Cadet, J., Davies, K. J. A., Medeiros, M. H., Di Mascio, P., Wagner, J. R. Formation and repair of oxidatively generated damage in cellular DNA. Free Radic Biol Med. 107, 13-34 (2017).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Jaruga, P., Dizdaroglu, M. Repair of products of oxidative DNA base damage in human cells. Nucleic Acids Res. 24 (8), 1389-1394 (1996).
- Fleming, A. M., Burrows, C. J. Chemistry of ROS-mediated oxidation to the guanine base in DNA and its biological consequences. Int J Radiat Biol. 98 (3), 452-460 (2022).
- Delaney, S., Jarem, D. A., Volle, C. B., Yennie, C. J. Chemical and biological consequences of oxidatively damaged guanine in DNA. Free Radic Res. 46 (4), 420-441 (2012).
- Wang, B., et al. Cross-sectional and longitudinal associations of acrolein exposure with pulmonary function alteration: Assessing the potential roles of oxidative DNA damage, inflammation, and pulmonary epithelium injury in a general adult population. Environ Int. 167, 107401 (2022).
- Chiorcea-Paquim, A. M. 8-oxoguanine and 8-oxodeoxyguanosine biomarkers of oxidative DNA damage: A review on HPLC-ECD determination. Molecules. 27 (5), (2022).
- He, L., Liu, X. L., Zhang, J. J. Simultaneous quantification of urinary 6-sulfatoxymelatonin and 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1095, 119-126 (2018).
- Lam, P. M., et al. Rapid measurement of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in human biological matrices using ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Free Radic Biol Med. 52 (10), 2057-2063 (2012).
- Machella, N., Regoli, F., Santella, R. M. Immunofluorescent detection of 8-oxo-DG and pah bulky adducts in fish liver and mussel digestive gland. Aquat Toxicol. 71 (4), 335-343 (2005).
- An, N., Fleming, A. M., White, H. S., Burrows, C. J. Nanopore detection of 8-oxoguanine in the human telomere repeat sequence. ACS Nano. 9 (4), 4296-4307 (2015).
- Xiao, S., Fleming, A. M., Burrows, C. J. Sequencing for oxidative DNA damage at single-nucleotide resolution with click-code-seq v2.0. Chem Commun (Camb). 59 (58), 8997-9000 (2023).
- Kong, W., Ji, Y., Zhu, X., Dai, X., You, C. Development and application of a chemical labeling-based biosensing assay for rapid detection of 8-oxoguanine and its repair in vitro and in human cells. Chinese J Chem. 40 (19), 2329-2334 (2022).
- Engvall, E., Perlmann, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin g. Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).
- Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. Review: Immunoassays in DNA damage and instability detection. Cell Mol Life Sci. 76 (23), 4689-4704 (2019).
- Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. J Invest Dermatol. 133 (9), e12 (2013).
- Ahirwar, R., Bhattacharya, A., Kumar, S. Unveiling the underpinnings of various non-conventional ELISA variants: A review article. Expert Rev Mol Diagn. 22 (7), 761-774 (2022).
- Li, D., et al. Magnetic nanochains-based dynamic elisa for rapid and ultrasensitive detection of acute myocardial infarction biomarkers. Anal Chim Acta. 1166, 338567 (2021).
- Tabatabaei, M. S., Islam, R., Ahmed, M. Applications of gold nanoparticles in ELISA, PCR, and immuno-pcr assays: A review. Anal Chim Acta. 1143, 250-266 (2021).
- Berlina, A. N., Zherdev, A. V., Dzantiev, B. B. ELISA and lateral flow immunoassay for the detection of food colorants: State of the art. Crit Rev Anal Chem. 49 (3), 209-223 (2019).
- Amber, K. T., Bloom, R., Hertl, M. A systematic review with pooled analysis of clinical presentation and immunodiagnostic testing in mucous membrane pemphigoid: Association of anti-laminin-332 IGG with oropharyngeal involvement and the usefulness of ELISA. J Eur Acad Dermatol Venereol. 30 (1), 72-77 (2016).
- Gervay, J., Mcreynolds, K. D. Utilization of elisa technology to measure biological activities of carbohydrates relevant in disease status. Curr Med Chem. 6 (2), 129-153 (1999).
- Tabatabaei, M. S., Ahmed, M. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Methods Mol Biol. 2508, 115-134 (2022).
- Aydin, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72, 4-15 (2015).
- Hayrapetyan, H., Tran, T., Tellez-Corrales, E., Madiraju, C. Enzyme-linked immunosorbent assay: Types and applications. Methods Mol Biol. 2612, 1-17 (2023).
- Eldahshoury, M. K., Hurley, I. P. Direct sandwich ELISA to detect the adulteration of human breast milk by cow milk. J Dairy Sci. 106 (9), 5908-5915 (2023).
- Tsumuraya, T., Hirama, M. Rationally designed synthetic haptens to generate anti-ciguatoxin monoclonal antibodies, and development of a practical sandwich ELISA to detect ciguatoxins. Toxins (Basel). 11 (9), 533 (2019).
- Ito, E., Iha, K., Yoshimura, T., Nakaishi, K., Watabe, S. Early diagnosis with ultrasensitive elisa). Adv Clin Chem. 101, 121-133 (2021).
- Larsson, P., Parris, T. Z. Optimization of cell viability assays for drug sensitivity screens. Methods Mol Biol. 2644, 287-302 (2023).
- Gunawardana, C. G., Diamandis, E. P. High throughput proteomic strategies for identifying tumour-associated antigens. Cancer Lett. 249 (1), 110-119 (2007).
- Zhang, S., et al. Development of a das-ELISA for gyrovirus homsa1 prevalence survey in chickens and wild birds in China. Vet Sci. 10 (5), 312 (2023).
- Li, Y., Sun, J., Shang, H. Effect of hogg1 expression level on oxidative DNA damage among workers exposed to nickel in stainless steel production environment. Zhonghua Lao Dong Wei Sheng Zhi Ye Bing Za Zhi. 32 (8), 578-581 (2014).
