Cuantificación del nivel de 8-oxo-dG mediante el ensayo ELISA para evaluar el daño oxidativo del ADN en células MCF-7

El daño oxidativo del ADN es consecuencia de un desequilibrio entre la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el sistema de defensa antioxidante celular¹. Implica principalmente la oxidación de las bases de ADN, purina y pirimidina ^2,3. Esta modificación oxidativa de las bases del ADN no solo compromete la integridad del genoma, sino que también abarca una amplia gama de problemas patológicos, como el cáncer, las enfermedades neurodegenerativas y las enfermedades cardiovasculares ^4,5. La base de guanina en el ADN tiene el menor potencial de reducción y es la más susceptible a la oxidación⁶. Por lo tanto, la 8-oxo-7,8-dihidro-2′-desoxiguanosina (8-oxo-dG) sirve como marcador primario para evaluar el grado de daño oxidativo del ADN ^7,8. La cuantificación precisa de 8-oxo-dG se ha convertido en una cuestión crítica para abordar diversos aspectos de la aparición de enfermedades, su progresión y la evaluación de la carga oxidativa multifactorial⁹.

Los métodos tradicionales para la detección de 8-oxo-dG, como la cromatografía líquida de alta resolución con detección electroquímica (HPLC-ECD), la espectrometría de masas y las técnicas relacionadas con guiones, presentan una alta sensibilidad y especificidad 10,11,12. Sin embargo, estas técnicas suelen tener requisitos operativos complejos y costes elevados, lo que dificulta su amplia aplicabilidad y practicidad en el análisis de muestras de alto rendimiento. Con el avance continuo de la ciencia y la tecnología, ha surgido una variedad de métodos nuevos, eficientes y precisos. La aplicación de estas nuevas tecnologías permite cuantificar el nivel de 8-oxo-dG con mayor precisión y proporciona herramientas más potentes para un estudio en profundidad de la asociación entre el estrés oxidativo y la enfermedad. Por ejemplo, los investigadores han aplicado la tecnología de nanoporos para detectar y secuenciar cuantitativamente el ADN¹³, identificar los tipos de daño del ADN utilizando una estrategia de secuenciación de código con un solo clic¹⁴, desarrollar métodos de secuenciación de alto rendimiento y crear biosensores basados en 8-oxoG mediante la integración de biotina-estreptavidina con ELISA¹⁵. Entre ellas, ELISA, con sus reconocidas ventajas en términos de especificidad, cribado de alto rendimiento y coste, es una de las soluciones ideales para la detección de 8-oxo-dG. Por lo tanto, es crucial desarrollar un método de alto rendimiento, altamente sensible, conveniente y rápido para detectar 8-oxo-dG.

La técnica de ensayo inmunoenzimático (ELISA), desarrollada en 1971¹⁶, ha avanzado rápidamente en los últimos 50 años y se ha convertido en uno de los métodos de detección más utilizados en los campos de la biología y la medicina 17,18,19. La tecnología ELISA exhibe una alta sensibilidad y especificidad, posee un tiempo de reacción corto y es fácil de usar, lo que la convierte en una opción ampliamente reconocida para pruebas de muestras a gran escala y análisis de alto rendimiento²⁰. Como resultado, ELISA ha sido ampliamente utilizado para el análisis cuantitativo o semicuantitativo de compuestos, proteínas, anticuerpos o moléculas dentro de las células 21,22,23. Por ejemplo, se ha utilizado en la detección de biomarcadores asociados a diversas enfermedades, residuos de fármacos y biomoléculas²⁴. Los ELISA se pueden clasificar en cuatro tipos principales basados en el diseño experimental y los principios²⁵. Estos métodos incluyen ELISA directo, ELISA indirecto, ELISA sándwich y ELISA competitivo^26,27. Entre estos, se eligió para el estudio en este trabajo el ELISA sándwich, que utiliza dos anticuerpos específicos, uno para capturar la molécula objetivo y otro para la detección. El principio experimental del ELISA sándwich es el siguiente: en primer lugar, se inmoviliza un anticuerpo específico en los pocillos de una microplaca para capturar el analito de interés. Una vez añadido el patrón o la muestra, el analito diana se une al anticuerpo inmovilizado. Posteriormente, se añade un anticuerpo marcado que reconoce un epítopo diferente en el antígeno, formando una estructura de sándwich. Tras la eliminación de los anticuerpos no unidos, se añade un sustrato. Bajo la acción catalítica del anticuerpo secundario, se produce una reacción de color y la intensidad del color se correlaciona positivamente con la concentración del analito objetivo en la muestra. Finalmente, se midió la densidad óptica (DO) para determinar la concentración de la muestra. El ELISA sándwich tiene las ventajas de una mayor sensibilidad y especificidad para las muestras objetivo, lo que lo hace adecuado para detectar bajas concentraciones de analitos objetivo y muestras complejas²⁸. Además, los resultados obtenidos pueden ser cuantificados para su posterior análisis. Estos factores hacen que el ELISA sándwich sea un método de detección comúnmente utilizado tanto en la investigación científica como en los laboratorios clínicos²⁹.

Este estudio tuvo como objetivo detectar cuantitativamente 8-oxo-dG en células MCF-7 para determinar el grado de daño oxidativo del ADN en las células. Este estudio consta de dos partes principales: la construcción de un modelo de daño oxidativo del ADN de la célula MCF-7 y la detección de 8-oxo-dG mediante ELISA. En primer lugar, las células MCF-7 se cultivaron in vitro y se trataron con diferentes concentraciones de_H2O2 durante diferentes duraciones. La viabilidad celular se evaluó mediante un ensayo CCK-8 para determinar la concentración inhibitoria semimáxima (IC₅₀) de_H2O2 en células MCF-7. Sobre la base de los valores de IC₅₀, se eligieron un tiempo de tratamiento de H₂O₂ y una concentración de inducción adecuados. Para extraer muestras de células MCF-7 dañadas por oxidación, se obtuvieron muestras celulares y sobrenadantes y se añadieron a pocillos ligados a enzimas previamente recubiertos con anticuerpos 8-oxo-dG. El 8-oxo-dG presente en la muestra se unirá a los anticuerpos unidos al portador en fase sólida. A continuación, se añadieron anticuerpos 8-oxo-dG marcados con peroxidasa de rábano picante. La mezcla de reacción se incubó a una temperatura constante para asegurar la unión completa de la muestra y el anticuerpo. La enzima no unida se eliminó mediante lavado y luego se agregó el sustrato colorimétrico, que produjo un color azul. Bajo la acción del ácido, la solución se volvió amarilla. Finalmente, el valor de OD de las muestras de los pocillos de reacción se midió a 450 nm, y la concentración de 8-oxo-dG en la muestra fue proporcional al valor de OD. Al generar una curva estándar, se puede calcular la concentración de 8-oxo-dG en la muestra.