Quantification du niveau de 8-oxo-dG à l’aide d’un test ELISA pour évaluer les dommages oxydatifs à l’ADN dans les cellules MCF-7

Les dommages oxydatifs de l’ADN sont la conséquence d’un déséquilibre entre la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et le système de défense antioxydant^{cellulaire 1}. Il s’agit principalement de l’oxydation de l’ADN, des bases^purine et pyrimidine ^2,3. Cette modification oxydative des bases de l’ADN compromet non seulement l’intégrité du génome, mais englobe également un large éventail de problèmes pathologiques, notamment le cancer, les maladies neurodégénératives et les maladies cardiovasculaires ^4,5. La base guanine de l’ADN a le potentiel de réduction le plus faible et est la plus sensible à l’oxydation⁶. Par conséquent, la 8-oxo-7,8-dihydro-2′-désoxyguanosine (8-oxo-dG) sert de marqueur primaire pour évaluer l’étendue des dommages oxydatifs de l’ADN ^7,8. La quantification précise du 8-oxo-dG est devenue un problème critique pour aborder divers aspects de l’apparition et de la progression de la maladie et de l’évaluation de la charge oxydative multifactorielle⁹.

Les méthodes traditionnelles de détection du 8-oxo-dG, telles que la chromatographie liquide à haute performance avec détection électrochimique (HPLC-ECD), la spectrométrie de masse et les techniques associées avec trait d’union, présentent une sensibilité et une spécificité élevées 10,11,12. Cependant, ces techniques ont souvent des exigences opérationnelles complexes et des coûts élevés, ce qui entrave leur applicabilité généralisée et leur praticité dans l’analyse d’échantillons à haut débit. Avec les progrès continus de la science et de la technologie, une variété de nouvelles méthodes efficaces et précises ont émergé. L’application de ces nouvelles technologies nous permet de quantifier plus précisément le niveau de 8-oxo-dG et fournit des outils plus puissants pour une étude approfondie de l’association entre le stress oxydatif et la maladie. Par exemple, les chercheurs ont appliqué la technologie des nanopores pour détecter et séquencer quantitativement l’ADN¹³, identifier les types de dommages à l’ADN à l’aide d’une stratégie de séquençage de code en un seul clic¹⁴, développer des méthodes de séquençage à haut débit et créer des biocapteurs basés sur le 8-oxoG en intégrant la biotine-streptavidine à ELISA¹⁵. Parmi elles, l’ELISA, avec ses avantages reconnus en termes de spécificité, de criblage à haut débit et de coût, est l’une des solutions idéales pour la détection 8-oxo-dG. Par conséquent, il est crucial de développer une méthode à haut débit, très sensible, pratique et rapide pour détecter le 8-oxo-dG.

La technique ELISA (enzyme-related immunosorbent assay), développée en 1971¹⁶, a rapidement progressé au cours des 50 dernières années et est maintenant devenue l’une des méthodes de détection les plus couramment utilisées dans les domaines de la biologie et de la médecine 17,18,19. La technologie ELISA présente une sensibilité et une spécificité élevées, possède un temps de réaction court et est facile à utiliser, ce qui en fait un choix largement reconnu pour les tests d’échantillons à grande échelle et l’analyse à haut débit²⁰. Par conséquent, l’ELISA a été largement utilisé pour l’analyse quantitative ou semi-quantitative de composés, de protéines, d’anticorps ou de molécules dans les cellules 21,22,23. Par exemple, il a été utilisé dans la détection de biomarqueurs associés à diverses maladies, résidus de médicaments et biomolécules²⁴. Les tests ELISA peuvent être classés en quatre types principaux sur la base de la conception expérimentale et des principes²⁵. Ces méthodes comprennent l’ELISA direct, l’ELISA indirect, l’ELISA sandwich et l’ELISA compétitif^26,27. Parmi ceux-ci, l’ELISA sandwich, qui utilise deux anticorps spécifiques, l’un pour capturer la molécule cible et l’autre pour la détection, a été choisi pour l’étude de cet article. Le principe expérimental de l’ELISA sandwich est le suivant : tout d’abord, un anticorps spécifique est immobilisé dans les puits d’une microplaque pour capturer l’analyte d’intérêt. Après l’ajout de l’étalon ou de l’échantillon, l’analyte cible se lie à l’anticorps immobilisé. Par la suite, un anticorps marqué qui reconnaît un épitope différent sur l’antigène est ajouté, formant une structure sandwich. Après l’élimination des anticorps non liés, un substrat est ajouté. Sous l’action catalytique de l’anticorps secondaire, une réaction de couleur se produit, et l’intensité de la couleur est positivement corrélée à la concentration de l’analyte cible dans l’échantillon. Enfin, la densité optique (DO) a été mesurée pour déterminer la concentration de l’échantillon. L’ELISA sandwich présente les avantages d’une sensibilité et d’une spécificité accrues pour les échantillons cibles, ce qui le rend adapté à la détection de faibles concentrations d’analytes cibles et d’échantillons complexes²⁸. De plus, les résultats obtenus peuvent être quantifiés pour une analyse plus approfondie. Ces facteurs font de l’ELISA sandwich une méthode de détection couramment utilisée dans la recherche scientifique et les laboratoires cliniques²⁹.

Cette étude visait à détecter quantitativement le 8-oxo-dG dans les cellules MCF-7 afin de déterminer le degré de dommages oxydatifs de l’ADN dans les cellules. Cette étude se compose de deux parties principales : la construction d’un modèle de dommages oxydatifs de l’ADN cellulaire MCF-7 et la détection du 8-oxo-dG à l’aide d’ELISA. Tout d’abord, les cellules MCF-7 ont été cultivées in vitro et traitées avec différentes concentrations de H₂O₂ pendant différentes durées. La viabilité cellulaire a été évaluée à l’aide d’un test CCK-8 pour déterminer la concentration inhibitrice demi-maximale (IC₅₀) de H₂O₂ dans les cellules MCF-7. Sur la base des valeurs CI₅₀ , un temps de traitement_H2O₂ et une concentration d’induction appropriés ont été choisis. Pour extraire des échantillons de cellules MCF-7 endommagées par l’oxydation, des échantillons de cellules et de surnageants ont été obtenus et ajoutés à des puits liés à des enzymes préalablement enrobés d’anticorps 8-oxo-dG. Le 8-oxo-dG présent dans l’échantillon se liera aux anticorps liés au porteur en phase solide. Ensuite, des anticorps 8-oxo-dG marqués à la peroxydase de raifort ont été ajoutés. Le mélange réactionnel a été incubé à une température constante pour assurer une liaison complète de l’échantillon et de l’anticorps. L’enzyme non liée a été éliminée par lavage, puis le substrat colorimétrique a été ajouté, ce qui a produit une couleur bleue. Sous l’action de l’acide, la solution est devenue jaune. Enfin, la valeur de DO des échantillons de puits de réaction a été mesurée à 450 nm, et la concentration de 8-oxo-dG dans l’échantillon était proportionnelle à la valeur de DO. En générant une courbe standard, la concentration de 8-oxo-dG dans l’échantillon peut être calculée.