Kwantificering van het niveau van 8-oxo-dG met behulp van ELISA-assay om oxidatieve DNA-schade in MCF-7-cellen te evalueren

DNA-oxidatieve schade is een gevolg van een onbalans tussen de aanmaak van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en het cellulaire^{antioxidantafweersysteem}. Het gaat voornamelijk om de oxidatie van DNA, purine en pyrimidinebasen ^2,3. Deze oxidatieve modificatie van DNA-basen brengt niet alleen de integriteit van het genoom in gevaar, maar omvat ook een breed scala aan pathologische problemen, waaronder kanker, neurodegeneratieve ziekten en hart- en vaatziekten ^4,5. De guaninebase in DNA heeft het laagste reductiepotentieel en is het meest vatbaar voor oxidatie⁶. Daarom dient 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine (8-oxo-dG) als een primaire marker voor het beoordelen van de mate van DNA-oxidatieve schade ^7,8. De nauwkeurige kwantificering van 8-oxo-dG is een cruciaal punt geworden bij het aanpakken van verschillende aspecten van het optreden en de progressie van de ziekte en de beoordeling van multifactoriële oxidatieve belasting^.

De traditionele methoden voor het detecteren van 8-oxo-dG, zoals hoogwaardige vloeistofchromatografie met elektrochemische detectie (HPLC-ECD), massaspectrometrie en gerelateerde technieken met koppeltekens, vertonen een hoge gevoeligheid en specificiteit 10,11,12. Deze technieken hebben echter vaak complexe operationele vereisten en hoge kosten, die hun wijdverbreide toepasbaarheid en bruikbaarheid bij monsteranalyse met hoge doorvoer belemmeren. Met de voortdurende vooruitgang van wetenschap en technologie is er een verscheidenheid aan nieuwe, efficiënte en nauwkeurige methoden ontstaan. De toepassing van deze nieuwe technologieën stelt ons in staat om het niveau van 8-oxo-dG nauwkeuriger te kwantificeren en biedt krachtigere instrumenten voor een diepgaande studie van het verband tussen oxidatieve stress en ziekte. Onderzoekers hebben bijvoorbeeld nanoporietechnologie toegepast om DNA¹³ kwantitatief te detecteren en te sequensen, DNA-schadetypes te identificeren met behulp van een single-click code-sequencing-strategie¹⁴, high-throughput sequencing-methoden te ontwikkelen en 8-oxoG-gebaseerde biosensoren te creëren door biotine-streptavidine te integreren met ELISA¹⁵. Onder hen is ELISA, met zijn erkende voordelen op het gebied van specificiteit, high-throughput screening en kosten, een van de ideale oplossingen voor 8-oxo-dG-detectie. Daarom is het van cruciaal belang om een hoge-doorvoer, zeer gevoelige, gemakkelijke en snelle methode te ontwikkelen voor het detecteren van 8-oxo-dG.

De ELISA-techniek (Enzyme-linked immunosorbent assay), ontwikkeld in 1971¹⁶, heeft zich de afgelopen 50 jaar snel ontwikkeld en is nu een van de meest gebruikte detectiemethoden op het gebied van biologie en geneeskunde geworden 17,18,19. ELISA-technologie vertoont een hoge gevoeligheid en specificiteit, heeft een korte reactietijd en is gemakkelijk te gebruiken, waardoor het een algemeen erkende keuze is voor grootschalige monstertests en high-throughput-analyse²⁰. Als gevolg hiervan is ELISA op grote schaal gebruikt voor kwantitatieve of semikwantitatieve analyse van verbindingen, eiwitten, antilichamen of moleculen in cellen 21,22,23. Het is bijvoorbeeld gebruikt bij de detectie van biomarkers die verband houden met verschillende ziekten, medicijnresten en biomoleculen²⁴. ELISA’s kunnen worden onderverdeeld in vier hoofdtypen op basis van experimenteel ontwerp en principes²⁵. Deze methoden omvatten directe ELISA, indirecte ELISA, sandwich ELISA^en competitieve ELISA ^26,27. Hiervan werd sandwich ELISA, die twee specifieke antilichamen gebruikt, één voor het vangen van het doelmolecuul en de andere voor detectie, gekozen voor de studie in dit artikel. Het experimentele principe van sandwich ELISA is als volgt: eerst wordt een specifiek antilichaam geïmmobiliseerd in de putjes van een microplaat om de betreffende analyt vast te leggen. Nadat de standaard of het monster is toegevoegd, bindt de doelanalyt zich aan het geïmmobiliseerde antilichaam. Vervolgens wordt een gelabeld antilichaam toegevoegd dat een ander epitoop op het antigeen herkent, waardoor een sandwichstructuur wordt gevormd. Na verwijdering van ongebonden antilichamen wordt een substraat toegevoegd. Onder de katalytische werking van het secundaire antilichaam vindt een kleurreactie plaats en is de intensiteit van de kleur positief gecorreleerd met de concentratie van de doelanalyt in het monster. Ten slotte werd de optische dichtheid (OD) gemeten om de concentratie van het monster te bepalen. Sandwich ELISA heeft de voordelen van een verhoogde gevoeligheid en specificiteit voor doelmonsters, waardoor het geschikt is voor het detecteren van lage concentraties doelanalyten en complexe monsters²⁸. Bovendien kunnen de verkregen resultaten worden gekwantificeerd voor verdere analyse. Deze factoren maken sandwich ELISA tot een veelgebruikte detectiemethode in zowel wetenschappelijk onderzoek als klinische laboratoria²⁹.

Deze studie was gericht op het kwantitatief detecteren van 8-oxo-dG in MCF-7-cellen om de mate van DNA-oxidatieve schade in de cellen te bepalen. Deze studie bestaat uit twee hoofdonderdelen: het construeren van een MCF-7-cel DNA-oxidatief schademodel en het detecteren van 8-oxo-dG met behulp van ELISA. Eerst werden MCF-7-cellen in vitro gekweekt en behandeld met verschillende concentraties H₂O₂ voor verschillende duur. De levensvatbaarheid van de cellen werd geëvalueerd met behulp van een CCK-8-test om de halfmaximale remmende concentratie (IC₅₀) van H₂O₂ in MCF-7-cellen te bepalen. Op basis van de IC_50-waarden is een geschikte H₂O₂ behandeltijd en inductieconcentratie gekozen. Om monsters van MCF-7-cellen te extraheren die door oxidatie waren beschadigd, werden celmonsters en supernatanten verkregen en toegevoegd aan enzymgekoppelde putten die eerder waren gecoat met 8-oxo-dG-antilichamen. De 8-oxo-dG die in het monster aanwezig is, zal zich binden aan de antilichamen die aan de vastefasedrager zijn gebonden. Vervolgens werden 8-oxo-dG-antilichamen gelabeld met mierikswortelperoxidase toegevoegd. Het reactiemengsel werd bij een constante temperatuur geïncubeerd om een volledige binding van het monster en het antilichaam te garanderen. Het ongebonden enzym werd verwijderd door te wassen en vervolgens werd het colorimetrische substraat toegevoegd, wat een blauwe kleur opleverde. Onder invloed van zuur werd de oplossing geel. Ten slotte werd de OD-waarde van de monsters van de reactieputjes gemeten bij 450 nm en was de concentratie van 8-oxo-dG in het monster evenredig met de OD-waarde. Door een standaardcurve te genereren, kan de concentratie van 8-oxo-dG in het monster worden berekend.