ELISAアッセイを用いた8-oxo-dGレベルの定量化によるMCF-7細胞の酸化的DNA損傷の評価

DNAの酸化的損傷は、活性酸素種(ROS)の生成と細胞の抗酸化防御システム¹との間の不均衡の結果です。これは主にDNAプリン塩基とピリミジン塩基の酸化を伴います^2,3。このDNA塩基の酸化的修飾は、ゲノムの完全性を損なうだけでなく、がん、神経変性疾患、心血管疾患など、幅広い病理学的問題を包含しています^4,5。DNA中のグアニン塩基は、還元電位が最も低く、酸化に対して最も影響を受けやすい⁶。したがって、8-オキソ-7,8-ジヒドロ-2′-デオキシグアノシン(8-オキソ-dG)は、DNA酸化的損傷の程度を評価するための主要なマーカーとして機能します^7,8。8-oxo-dGの正確な定量は、疾患の発生、進行、および多因子酸化負荷の評価のさまざまな側面に対処する上で重要な問題となっています⁹。

電気化学検出付き高速液体クロマトグラフィー(HPLC-ECD)、質量分析、および関連するハイフン技術など、8-oxo-dGを検出するための従来の方法は、高い感度と特異性を示します10,11,12。しかし、これらの手法は複雑な運用要件と高コストを伴うことが多く、ハイスループットサンプル分析における広範な適用性と実用性が妨げられています。科学技術の絶え間ない進歩に伴い、さまざまな新しい効率的で正確な方法が登場しています。これらの新技術の適用により、8-oxo-dGのレベルをより正確に定量化できるようになり、酸化ストレスと疾患との関連を詳細に研究するためのより強力なツールが提供されます。例えば、研究者はナノポア技術を適用して^DNA13を定量的に検出し、配列決定を行い、シングルクリックコードシーケンシング戦略¹⁴を使用してDNA損傷タイプを特定し、ハイスループットシーケンシング法を開発し、ビオチンストレプトアビジンとELISAを統合して8-oxoGベースのバイオセンサーを作成しました¹⁵。その中でも、特異性、ハイスループットスクリーニング、およびコストの点で認められている利点を持つELISAは、8-oxo-dG検出の理想的なソリューションの1つです。したがって、ハイスループット、高感度、便利、かつ迅速な8-oxo-dG検出法を開発することが重要です。

1971年に開発された酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)¹⁶技術は、過去50年間で急速に進歩し、現在では生物学および医学の分野で最も一般的に使用される検出方法の1つになっています17,18,19。ELISA技術は、高い感度と特異性を示し、反応時間が短く、使いやすいため、大規模なサンプルテストやハイスループット分析の選択肢として広く認識されています²⁰。その結果、ELISAは、細胞内の化合物、タンパク質、抗体、または分子の定量的または半定量的分析に広く使用されています21,22,23。例えば、それは、種々の疾患、薬物残留物、および生体分子²⁴に関連するバイオマーカーの検出に利用されてきた。ELISAは、実験デザインと原則に基づいて、主に4つのタイプに分類できます²⁵。これらの方法には、直接 ELISA、間接 ELISA、サンドイッチ ELISA、および競合 ELISA ^26,27 が含まれます。その中でも、標的分子を捕捉するための抗体と検出用の抗体の2つの特異的抗体を利用したサンドイッチELISAが、この論文の研究に選ばれました。サンドイッチELISAの実験原理は次のとおりです:まず、特定の抗体をマイクロプレートのウェルに固定化して、目的の分析物を捕捉します。標準試料またはサンプルを添加した後、標的分析物は固定化抗体に結合します。続いて、抗原上の異なるエピトープを認識する標識抗体を添加し、サンドイッチ構造を形成する。非結合抗体を除去した後、基質を添加します。二次抗体の触媒作用下で色反応が起こり、色の強度はサンプル中の標的分析物の濃度と正の相関があります。最後に、光学密度(OD)を測定して、サンプルの濃度を決定しました。Sandwich ELISAには、ターゲットサンプルの感度と特異性が向上するという利点があり、低濃度のターゲット分析物や複雑なサンプルの検出に適しています²⁸。さらに、得られた結果を定量化して、さらなる分析を行うことができます。これらの要因により、サンドイッチELISAは科学研究と臨床検査室の両方で一般的に使用される検出方法となっています²⁹。

本研究は、MCF-7細胞中の8-oxo-dGを定量的に検出し、細胞内のDNA酸化的損傷の程度を決定することを目的としています。本研究は、MCF-7細胞DNA酸化的損傷モデルの構築と、ELISAを用いた8-oxo-dGの検出という2つの主要な部分から構成されています。まず、MCF-7細胞をin vitroで培養し、異なる濃度のH₂O₂で異なる期間処理した。CCK-8アッセイを用いて細胞生存率を評価し、MCF-7細胞におけるH₂O₂の半値阻害濃度(IC₅₀)を決定しました。IC₅₀の値に基づいて、適切なH₂O₂処理時間と誘導濃度を選択しました。酸化によって損傷を受けたMCF-7細胞のサンプルを抽出するために、細胞サンプルと上清を採取し、8-oxo-dG抗体でコーティングした酵素結合ウェルに添加しました。サンプル中に存在する8-oxo-dGは、固相キャリアに結合した抗体に結合します。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された8-oxo-dG抗体を添加しました。反応混合物を一定温度でインキュベートして、サンプルと抗体が完全に結合するようにしました。未結合の酵素を洗浄して除去し、次に比色基質を添加すると、青色が生じました。酸の作用下で、溶液は黄色に変わった。最後に、反応井試料のOD値を450nmで測定し、試料中の8-oxo-dGの濃度はOD値に比例した。標準曲線を作成することにより、サンプル中の8-oxo-dGの濃度を計算できます。