تحديد مستوى 8-oxo-dG باستخدام مقايسة ELISA لتقييم تلف الحمض النووي التأكسدي في خلايا MCF-7
Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة فعالة للكشف الكمي عن الضرر التأكسدي للحمض النووي في خلايا MCF-7 بواسطة تقنية ELISA.
Abstract
قاعدة 8-Oxo-7،8-dihydro-2′-deoxyguanosine (8-oxo-dG) هي الشكل السائد للضرر التأكسدي للحمض النووي الذي يتم ملاحظته بشكل شائع. يؤثر ضعف الحمض النووي بشكل عميق على التعبير الجيني ويعمل كعامل محوري في تحفيز الاضطرابات التنكسية العصبية والسرطان والشيخوخة. لذلك ، فإن القياس الكمي الدقيق ل 8-oxoG له أهمية سريرية في التحقيق في منهجيات الكشف عن تلف الحمض النووي. ومع ذلك ، في الوقت الحاضر ، تشكل الأساليب الحالية للكشف عن 8-oxoG تحديات من حيث الراحة والنفعية والقدرة على تحمل التكاليف والحساسية المتزايدة. استخدمنا تقنية مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) ، وهي طريقة قياس لوني عالية الكفاءة وسريعة ، للكشف عن الاختلافات في محتوى 8-oxo-dG في عينات خلايا MCF-7 المحفزة بتركيزات مختلفة من بيروكسيد الهيدروجين (H2O2). حددنا تركيز H2O2 الذي تسبب في الضرر التأكسدي في خلايا MCF-7 عن طريق الكشف عن قيمة IC50 في خلايا MCF-7. بعد ذلك ، عالجنا خلايا MCF-7 ب 0 و 0.25 و 0.75 mMH 2O2 لمدة 12 ساعة واستخلصنا 8-oxo-dG من الخلايا. أخيرا ، خضعت العينات ل ELISA. باتباع سلسلة من الخطوات ، بما في ذلك نشر اللوحة ، والغسيل ، والحضانة ، وتطوير اللون ، وإنهاء التفاعل ، وجمع البيانات ، اكتشفنا بنجاح التغييرات في محتوى 8-oxo-dG في خلايا MCF-7 التي يسببها H2O2. من خلال هذه المساعي ، نهدف إلى إنشاء طريقة لتقييم درجة الضرر التأكسدي للحمض النووي داخل عينات الخلايا ، وبذلك ، ندفع قدما في تطوير مناهج أكثر ملاءمة وملاءمة للكشف عن تلف الحمض النووي. يستعد هذا المسعى لتقديم مساهمة ذات مغزى في استكشاف التحليلات الترابطية بين الضرر التأكسدي للحمض النووي ومختلف المجالات ، بما في ذلك البحوث السريرية حول الأمراض والكشف عن المواد السامة.
Introduction
الضرر التأكسدي للحمض النووي هو نتيجة لعدم التوازن بين توليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ونظام الدفاع الخلوي المضاد للأكسدة1. وهو ينطوي في المقام الأول على أكسدة الحمض النووي البيورين وقواعدالبيريميدين 2,3. هذا التعديل التأكسدي لقواعد الحمض النووي لا يضر بسلامة الجينوم فحسب ، بل يشمل أيضا مجموعة واسعة من المشكلات المرضية ، بما في ذلك السرطان والأمراض التنكسية العصبية وأمراض القلب والأوعية الدموية 4,5. قاعدة الجوانين في الحمض النووي لديها أقل إمكانية اختزال وهي الأكثر عرضة للأكسدة6. لذلك ، يعمل 8-oxo-7،8-dihydro-2′-deoxyguanosine (8-oxo-dG) كعلامة أولية لتقييم مدى الضرر التأكسدي للحمض النووي 7,8. أصبح القياس الكمي الدقيق ل 8-oxo-dG قضية حاسمة في معالجة الجوانب المختلفة لحدوث المرض وتطوره وتقييم عبء الأكسدة متعدد العوامل9.
الطرق التقليدية للكشف عن 8-oxo-dG ، مثل اللوني السائل عالي الأداء مع الكشف الكهروكيميائي (HPLC-ECD) ، وقياس الطيف الكتلي ، والتقنيات الواصلة ذات الصلة ، تظهر حساسية عالية وخصوصية10،11،12. ومع ذلك ، غالبا ما يكون لهذه التقنيات متطلبات تشغيلية معقدة وتكاليف عالية ، مما يعوق قابليتها للتطبيق على نطاق واسع وعمليتها في تحليل العينات عالي الإنتاجية. مع التقدم المستمر للعلوم والتكنولوجيا ، ظهرت مجموعة متنوعة من الأساليب الجديدة والفعالة والدقيقة. يتيح لنا تطبيق هذه التقنيات الجديدة تحديد مستوى 8-oxo-dG بشكل أكثر دقة ويوفر أدوات أكثر قوة لإجراء دراسة متعمقة للارتباط بين الإجهاد التأكسدي والمرض. على سبيل المثال ، طبق الباحثون تقنية المسام النانوية للكشف الكمي عن الحمض النووي13 وتسلسله ، وتحديد أنواع تلف الحمض النووي باستخدام استراتيجية تسلسل الكود بنقرة واحدة14 ، وتطوير طرق تسلسل عالية الإنتاجية ، وإنشاء مستشعرات حيوية قائمة على 8-oxoG من خلال دمج البيوتين ستربتافيدين مع ELISA15. من بينها ، ELISA ، بمزاياها المعترف بها من حيث الخصوصية والفحص عالي الإنتاجية والتكلفة ، هي واحدة من الحلول المثالية للكشف عن 8-oxo-dG. لذلك ، من الأهمية بمكان تطوير طريقة عالية الإنتاجية وحساسة للغاية ومريحة وسريعة للكشف عن 8-oxo-dG.
تقدمت تقنية مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) ، التي تم تطويرها في 197116 ، بسرعة على مدار ال 50 عاما الماضية وأصبحت الآن واحدة من أكثر طرق الكشف شيوعا في مجالات البيولوجيا والطب17،18،19. تظهر تقنية ELISA حساسية وخصوصية عالية ، وتمتلك وقت رد فعل قصير ، وسهلة الاستخدام ، مما يجعلها خيارا معترفا به على نطاق واسع لاختبار العينات على نطاق واسع وتحليل عالي الإنتاجية20. نتيجة لذلك ، تم استخدام ELISA على نطاق واسع للتحليل الكمي أو شبه الكمي للمركبات أو البروتينات أو الأجسام المضادة أو الجزيئات داخل الخلايا21،22،23. على سبيل المثال ، تم استخدامه في الكشف عن المؤشرات الحيوية المرتبطة بالأمراض المختلفة وبقايا الأدوية والجزيئات الحيوية24. يمكن تصنيف ELISAs إلى أربعة أنواع رئيسية بناء على التصميم التجريبي والمبادئ25. تشمل هذه الطرق ELISA المباشر ، و ELISA غير المباشر ، و ELISA الساندويتش ، و ELISA26,27 التنافسي. من بين هذه ، شطيرة ELISA ، التي تستخدم اثنين من الأجسام المضادة المحددة ، واحد لالتقاط الجزيء المستهدف والآخر للكشف ، تم اختياره للدراسة في هذه الورقة. المبدأ التجريبي لشطيرة ELISA هو كما يلي: أولا ، يتم تثبيت جسم مضاد معين في آبار الصفيحة الدقيقة لالتقاط المادة المراد تحليلها. بعد إضافة المعيار أو العينة، يرتبط المحلول المراد تحليله بالجسم المضاد المتجمد. بعد ذلك ، يضاف جسم مضاد مسمى يتعرف على حاشية مختلفة على المستضد ، مكونا بنية شطيرة. بعد إزالة الأجسام المضادة غير المنضمة ، تتم إضافة الركيزة. تحت التأثير الحفاز للجسم المضاد الثانوي ، يحدث تفاعل اللون ، وترتبط شدة اللون ارتباطا إيجابيا بتركيز المادة المراد تحليلها في العينة. أخيرا ، تم قياس الكثافة الضوئية (OD) لتحديد تركيز العينة. يتميز Sandwich ELISA بمزايا زيادة الحساسية والنوعية للعينات المستهدفة ، مما يجعله مناسبا للكشف عن تركيزات منخفضة من التحليلات المستهدفة والعينات المعقدة28. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن قياس النتائج التي تم الحصول عليها لمزيد من التحليل. هذه العوامل تجعل شطيرة ELISA طريقة كشف شائعة الاستخدام في كل من البحث العلمي والمختبرات السريرية29.
تهدف هذه الدراسة إلى الكشف الكمي عن 8-oxo-dG في خلايا MCF-7 لتحديد درجة الضرر التأكسدي للحمض النووي في الخلايا. تتكون هذه الدراسة من جزأين رئيسيين: بناء نموذج الضرر التأكسدي للحمض النووي لخلية MCF-7 والكشف عن 8-oxo-dG باستخدام ELISA. أولا ، تم استزراع خلايا MCF-7 في المختبر ومعالجتها بتركيزات مختلفة من H2O2 لفترات مختلفة. تم تقييم صلاحية الخلية باستخدام مقايسة CCK-8 لتحديد التركيز المثبط نصف الأقصى (IC50) ل H2O2 في خلايا MCF-7. بناء على قيم IC50 ، تم اختياروقت علاج H 2O 2 المناسب وتركيز الحث. لاستخراج عينات من خلايا MCF-7 التي تضررت من الأكسدة ، تم الحصول على عينات الخلايا والمواد الطافية وإضافتها إلى الآبار المرتبطة بالإنزيم المطلية مسبقا بأجسام مضادة 8-oxo-dG. سوف يرتبط 8-oxo-dG الموجود في العينة بالأجسام المضادة المرتبطة بحامل الطور الصلب. بعد ذلك ، تمت إضافة 8-oxo-dG الأجسام المضادة الموسومة ببيروكسيديز الفجل. تم تحضين خليط التفاعل عند درجة حرارة ثابتة لضمان الارتباط الكامل للعينة والجسم المضاد. تمت إزالة الإنزيم غير المنضم عن طريق الغسيل ، ثم تمت إضافة الركيزة اللونية ، والتي أنتجت لونا أزرق. تحت تأثير الحمض ، تحول المحلول إلى اللون الأصفر. أخيرا ، تم قياس قيمة OD لعينات بئر التفاعل عند 450 نانومتر ، وكان تركيز 8-oxo-dG في العينة متناسبا مع قيمة OD. من خلال توليد منحنى قياسي ، يمكن حساب تركيز 8-oxo-dG في العينة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يحمل تطوير طرق ELISA أهمية كبيرة لكل من منهجيات الكشف عن تلف الحمض النووي الحالية والجديدة. بالمقارنة مع تقنيات HPLC التقليدية وقياس الطيف الكتلي ، فإن هذا النهج ليس سهل الاستخدام فحسب ، بل يظهر أيضا حساسية عالية ويلبي متطلبات الفحص عالي الإنتاجية30. يتيح ذلك مراقبة 8-oxo-dG في دراسات …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل فريق البحث المبتكر لمؤسسة جيانغسو للتعليم العالي للعلوم والتكنولوجيا (2021) ، وبرنامج مركز أبحاث تكنولوجيا الهندسة بكلية جيانغسو المهنية (2023) ، وبرنامج التكنولوجيا الرئيسية لمشاريع تكنولوجيا معيشة شعب سوتشو (SKY2021029) ، والمشروع المفتوح لبنك جيانغسو الحيوي للموارد السريرية (TC2021B009) ، ومشروع مختبر الدولة الرئيسي للطب الإشعاعي والحماية ، جامعة سوشو (GZK12023013) ، وبرامج كلية سوتشو للصحة المهنية (SZWZYTD202201) ، ومشروع تشينغ لان بمقاطعة جيانغسو في الصين (2021 ، 2022).
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA(1x) | Gibco | 25200-072 | |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo | CK04 | |
| Cell Counting Plate | QiuJing | XB-K-25 | |
| CO2 incubator | Thermo | 51032872 | |
| DMEM basic(1X) | Gibco | C11995500BT | |
| FBS | PAN | ST30-3302 | |
| GraphPad Prism X9 | GraphPad Software | statistical analysis software | |
| H2O2(3%) | Jiangxi Caoshanhu Disinfection Co.,Ltd. | 1028348 | |
| high-speed centrifuge | Thermo | 9AQ2861 | |
| Human 8-oxo-dG ELISA Kit | Zcibio | ZC-55410 | |
| L-1000XLS+ Pipettes | Rainin | 17014382 | |
| L-20XLS+ Pipettes | Rainin | 17014392 | |
| liquid nitrogen tank | Mvecryoge | YDS-175-216 | |
| MCF-7 CELL | BNCC | BNCC100137 | |
| Multiskan FC microplate photometer | Thermo | 1410101 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Beyotime | C0222 | |
| Trinocular live cell microscope | Motic | 1.1001E+12 | |
| Ultra-low temperature freezer | Haire | V118574 |
References
- Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: Mechanisms, mutation, and disease. Faseb J. 17 (10), 1195-1214 (2003).
- Dizdaroglu, M., Jaruga, P. Mechanisms of free radical-induced damage to DNA. Free Radic Res. 46 (4), 382-419 (2012).
- Cadet, J., Davies, K. J. A., Medeiros, M. H., Di Mascio, P., Wagner, J. R. Formation and repair of oxidatively generated damage in cellular DNA. Free Radic Biol Med. 107, 13-34 (2017).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Jaruga, P., Dizdaroglu, M. Repair of products of oxidative DNA base damage in human cells. Nucleic Acids Res. 24 (8), 1389-1394 (1996).
- Fleming, A. M., Burrows, C. J. Chemistry of ROS-mediated oxidation to the guanine base in DNA and its biological consequences. Int J Radiat Biol. 98 (3), 452-460 (2022).
- Delaney, S., Jarem, D. A., Volle, C. B., Yennie, C. J. Chemical and biological consequences of oxidatively damaged guanine in DNA. Free Radic Res. 46 (4), 420-441 (2012).
- Wang, B., et al. Cross-sectional and longitudinal associations of acrolein exposure with pulmonary function alteration: Assessing the potential roles of oxidative DNA damage, inflammation, and pulmonary epithelium injury in a general adult population. Environ Int. 167, 107401 (2022).
- Chiorcea-Paquim, A. M. 8-oxoguanine and 8-oxodeoxyguanosine biomarkers of oxidative DNA damage: A review on HPLC-ECD determination. Molecules. 27 (5), (2022).
- He, L., Liu, X. L., Zhang, J. J. Simultaneous quantification of urinary 6-sulfatoxymelatonin and 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1095, 119-126 (2018).
- Lam, P. M., et al. Rapid measurement of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in human biological matrices using ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Free Radic Biol Med. 52 (10), 2057-2063 (2012).
- Machella, N., Regoli, F., Santella, R. M. Immunofluorescent detection of 8-oxo-DG and pah bulky adducts in fish liver and mussel digestive gland. Aquat Toxicol. 71 (4), 335-343 (2005).
- An, N., Fleming, A. M., White, H. S., Burrows, C. J. Nanopore detection of 8-oxoguanine in the human telomere repeat sequence. ACS Nano. 9 (4), 4296-4307 (2015).
- Xiao, S., Fleming, A. M., Burrows, C. J. Sequencing for oxidative DNA damage at single-nucleotide resolution with click-code-seq v2.0. Chem Commun (Camb). 59 (58), 8997-9000 (2023).
- Kong, W., Ji, Y., Zhu, X., Dai, X., You, C. Development and application of a chemical labeling-based biosensing assay for rapid detection of 8-oxoguanine and its repair in vitro and in human cells. Chinese J Chem. 40 (19), 2329-2334 (2022).
- Engvall, E., Perlmann, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin g. Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).
- Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. Review: Immunoassays in DNA damage and instability detection. Cell Mol Life Sci. 76 (23), 4689-4704 (2019).
- Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. J Invest Dermatol. 133 (9), e12 (2013).
- Ahirwar, R., Bhattacharya, A., Kumar, S. Unveiling the underpinnings of various non-conventional ELISA variants: A review article. Expert Rev Mol Diagn. 22 (7), 761-774 (2022).
- Li, D., et al. Magnetic nanochains-based dynamic elisa for rapid and ultrasensitive detection of acute myocardial infarction biomarkers. Anal Chim Acta. 1166, 338567 (2021).
- Tabatabaei, M. S., Islam, R., Ahmed, M. Applications of gold nanoparticles in ELISA, PCR, and immuno-pcr assays: A review. Anal Chim Acta. 1143, 250-266 (2021).
- Berlina, A. N., Zherdev, A. V., Dzantiev, B. B. ELISA and lateral flow immunoassay for the detection of food colorants: State of the art. Crit Rev Anal Chem. 49 (3), 209-223 (2019).
- Amber, K. T., Bloom, R., Hertl, M. A systematic review with pooled analysis of clinical presentation and immunodiagnostic testing in mucous membrane pemphigoid: Association of anti-laminin-332 IGG with oropharyngeal involvement and the usefulness of ELISA. J Eur Acad Dermatol Venereol. 30 (1), 72-77 (2016).
- Gervay, J., Mcreynolds, K. D. Utilization of elisa technology to measure biological activities of carbohydrates relevant in disease status. Curr Med Chem. 6 (2), 129-153 (1999).
- Tabatabaei, M. S., Ahmed, M. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Methods Mol Biol. 2508, 115-134 (2022).
- Aydin, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72, 4-15 (2015).
- Hayrapetyan, H., Tran, T., Tellez-Corrales, E., Madiraju, C. Enzyme-linked immunosorbent assay: Types and applications. Methods Mol Biol. 2612, 1-17 (2023).
- Eldahshoury, M. K., Hurley, I. P. Direct sandwich ELISA to detect the adulteration of human breast milk by cow milk. J Dairy Sci. 106 (9), 5908-5915 (2023).
- Tsumuraya, T., Hirama, M. Rationally designed synthetic haptens to generate anti-ciguatoxin monoclonal antibodies, and development of a practical sandwich ELISA to detect ciguatoxins. Toxins (Basel). 11 (9), 533 (2019).
- Ito, E., Iha, K., Yoshimura, T., Nakaishi, K., Watabe, S. Early diagnosis with ultrasensitive elisa). Adv Clin Chem. 101, 121-133 (2021).
- Larsson, P., Parris, T. Z. Optimization of cell viability assays for drug sensitivity screens. Methods Mol Biol. 2644, 287-302 (2023).
- Gunawardana, C. G., Diamandis, E. P. High throughput proteomic strategies for identifying tumour-associated antigens. Cancer Lett. 249 (1), 110-119 (2007).
- Zhang, S., et al. Development of a das-ELISA for gyrovirus homsa1 prevalence survey in chickens and wild birds in China. Vet Sci. 10 (5), 312 (2023).
- Li, Y., Sun, J., Shang, H. Effect of hogg1 expression level on oxidative DNA damage among workers exposed to nickel in stainless steel production environment. Zhonghua Lao Dong Wei Sheng Zhi Ye Bing Za Zhi. 32 (8), 578-581 (2014).
