MCF-7 Hücrelerinde Oksidatif DNA Hasarını Değerlendirmek için ELISA Testi Kullanılarak 8-okso-dG Seviyesinin Ölçülmesi
Summary
Bu protokol, ELISA teknolojisi ile MCF-7 hücrelerinde DNA oksidatif hasarını kantitatif olarak tespit etmek için etkili bir yöntemi tanımlar.
Abstract
8-Okso-7,8-dihidro-2′-deoksiguanozin (8-okso-dG) bazı, yaygın olarak gözlenen DNA oksidatif hasarının baskın şeklidir. DNA bozukluğu, gen ekspresyonunu derinden etkiler ve nörodejeneratif bozuklukları, kanseri ve yaşlanmayı uyarmada çok önemli bir faktör olarak hizmet eder. Bu nedenle, 8-oksoG’nin kesin miktar tayini, DNA hasar tespit metodolojilerinin araştırılmasında klinik öneme sahiptir. Bununla birlikte, şu anda, 8-oxoG tespiti için mevcut yaklaşımlar, kolaylık, uygunluk, satın alınabilirlik ve yüksek hassasiyet açısından zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Farklı konsantrasyonlarda hidrojen peroksit(H2O2) ile uyarılan MCF-7 hücre örneklerinde 8-okso-dG içeriğindeki varyasyonları tespit etmek için oldukça verimli ve hızlı bir kolorimetrik yöntem olan sandviç enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) tekniğini kullandık. MCF-7 hücrelerinde oksidatif hasara neden olanH2O2 konsantrasyonunu, MCF-7 hücrelerinde IC50 değerini tespit ederek belirledik. Daha sonra, MCF-7 hücrelerini 12 saat boyunca 0, 0.25 ve 0.75 mM H2O2 ile tedavi ettik ve hücrelerden 8-okso-dG çıkardık. Son olarak numuneler ELISA’ya tabi tutulmuştur. Plaka yayma, yıkama, inkübasyon, renk geliştirme, reaksiyonun sonlandırılması ve veri toplama dahil olmak üzere bir dizi adımın ardından,H2O2tarafından indüklenen MCF-7 hücrelerindeki 8-okso-dG içeriğindeki değişiklikleri başarıyla tespit ettik. Bu tür çabalar sayesinde, hücre örneklerinde DNA oksidatif hasarının derecesini değerlendirmek için bir yöntem oluşturmayı ve bunu yaparken DNA hasarının tespiti için daha uygun ve uygun yaklaşımların geliştirilmesini ilerletmeyi amaçlıyoruz. Bu çaba, DNA oksidatif hasarı ile hastalıklar üzerine klinik araştırmalar ve toksik maddelerin tespiti de dahil olmak üzere çeşitli alanlar arasındaki ilişkisel analizlerin araştırılmasına anlamlı bir katkı sağlamaya hazırdır.
Introduction
DNA oksidatif hasarı, reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumu ile hücresel antioksidan savunma sistemi arasındaki dengesizliğin bir sonucudur1. Esas olarak DNA pürin ve pirimidin bazlarınınoksidasyonunu içerir 2,3. DNA bazlarının bu oksidatif modifikasyonu sadece genomun bütünlüğünü tehlikeye atmakla kalmaz, aynı zamanda kanser, nörodejeneratif hastalıklar ve kardiyovasküler hastalıklar dahil olmak üzere çok çeşitli patolojik sorunları da kapsar 4,5. DNA’daki guanin bazı en düşük indirgeme potansiyeline sahiptir ve oksidasyona en duyarlıolanıdır 6. Bu nedenle, 8-okso-7,8-dihidro-2′-deoksiguanozin (8-okso-dG), DNA oksidatif hasarının derecesini değerlendirmek için birincil belirteçgörevi görür 7,8. 8-okso-dG’nin doğru miktar tayini, hastalık oluşumunun, ilerlemesinin ve multifaktöriyel oksidatif yükün9 değerlendirilmesinin çeşitli yönlerinin ele alınmasında kritik bir konu haline gelmiştir.
Elektrokimyasal algılamalı yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC-ECD), kütle spektrometresi ve ilgili tireli teknikler gibi 8-okso-dG’yi tespit etmek için geleneksel yöntemler, yüksek hassasiyet ve özgüllük sergiler 10,11,12. Bununla birlikte, bu teknikler genellikle karmaşık operasyonel gereksinimlere ve yüksek maliyetlere sahiptir, bu da yüksek verimli numune analizinde yaygın olarak uygulanabilirliklerini ve pratikliklerini engeller. Bilim ve teknolojinin sürekli ilerlemesiyle birlikte çeşitli yeni, verimli ve doğru yöntemler ortaya çıkmıştır. Bu yeni teknolojilerin uygulanması, 8-okso-dG seviyesini daha doğru bir şekilde ölçmemizi sağlar ve oksidatif stres ile hastalık arasındaki ilişkinin derinlemesine incelenmesi için daha güçlü araçlar sağlar. Örneğin, araştırmacılar DNA13’ü kantitatif olarak tespit etmek ve sıralamak, tek tıklamalı kod dizileme stratejisi14 kullanarak DNA hasar türlerini belirlemek, yüksek verimli dizileme yöntemleri geliştirmek ve biyotin-streptavidin ile entegre ederek 8-oksoG tabanlı biyosensörler oluşturmak için nanopor teknolojisini uyguladılar. Bunlar arasında, özgüllük, yüksek verimli tarama ve maliyet açısından tanınan avantajları ile ELISA, 8-okso-dG tespiti için ideal çözümlerden biridir. Bu nedenle, 8-oxo-dG’yi tespit etmek için yüksek verimli, son derece hassas, kullanışlı ve hızlı bir yöntem geliştirmek çok önemlidir.
1971’degeliştirilen enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) tekniği 16, son 50 yılda hızla ilerlemiş ve şu anda biyoloji ve tıp alanlarında en yaygın kullanılan tespit yöntemlerinden biri haline gelmiştir 17,18,19. ELISA teknolojisi, yüksek hassasiyet ve özgüllük sergiler, kısa bir reaksiyon süresine sahiptir ve kullanımı kolaydır, bu da onu büyük ölçekli numune testi ve yüksek verimli analiz için yaygın olarak tanınan bir seçim haline getirir20. Sonuç olarak, ELISA, hücreler 21,22,23 içindeki bileşiklerin, proteinlerin, antikorların veya moleküllerin kantitatif veya yarı kantitatif analizi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Örneğin, çeşitli hastalıklar, ilaç kalıntıları ve biyomoleküller ile ilişkili biyobelirteçlerin tespitinde kullanılmıştır24. ELISA’lar deney tasarımı ve ilkelerine dayalı olarak dört ana türe ayrılabilir25. Bu yöntemler arasında doğrudan ELISA, dolaylı ELISA, sandviç ELISA ve rekabetçi ELISA26,27 bulunur. Bunlar arasında, biri hedef molekülü yakalamak ve diğeri tespit etmek için olmak üzere iki spesifik antikor kullanan sandviç ELISA, bu makaledeki çalışma için seçildi. Sandviç ELISA’nın deneysel prensibi şu şekildedir: İlk olarak, ilgilenilen analiti yakalamak için bir mikroplakanın kuyucuklarında spesifik bir antikor hareketsiz hale getirilir. Standart veya numune eklendikten sonra, hedef analit immobilize edilmiş antikora bağlanır. Daha sonra, antijen üzerinde farklı bir epitopu tanıyan etiketli bir antikor eklenir ve bir sandviç yapı oluşturulur. Bağlanmamış antikorların uzaklaştırılmasını takiben, bir substrat eklenir. İkincil antikorun katalitik etkisi altında, bir renk reaksiyonu meydana gelir ve rengin yoğunluğu, numunedeki hedef analitin konsantrasyonu ile pozitif olarak ilişkilidir. Son olarak, numunenin konsantrasyonunu belirlemek için optik yoğunluk (OD) ölçüldü. Sandviç ELISA, hedef numuneler için artan hassasiyet ve özgüllük avantajlarına sahiptir, bu da onu düşük konsantrasyonlarda hedef analitlerin ve karmaşık numunelerin28 tespit edilmesi için uygun hale getirir. Ek olarak, elde edilen sonuçlar daha fazla analiz için nicelleştirilebilir. Bu faktörler, sandviç ELISA’yı hem bilimsel araştırmalarda hem de klinik laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılan bir tespit yöntemi haline getirmektedir29.
Bu çalışma, hücrelerdeki DNA oksidatif hasarının derecesini belirlemek için MCF-7 hücrelerinde 8-okso-dG’yi kantitatif olarak tespit etmeyi amaçladı. Bu çalışma iki ana bölümden oluşmaktadır: bir MCF-7 hücre DNA oksidatif hasar modelinin oluşturulması ve ELISA kullanılarak 8-okso-dG’nin saptanması. İlk olarak, MCF-7 hücreleri in vitro olarak kültürlendi ve farklı süreler boyunca farklı konsantrasyonlardaH2O2ile muamele edildi. Hücre canlılığı, MCF-7 hücrelerinde H2O2’nin yarı maksimal inhibitör konsantrasyonunu (IC50) belirlemek için birCCK-8 testi kullanılarak değerlendirildi. IC50 değerlerine dayanarak, uygun bir H2O2 tedavi süresi ve indüksiyon konsantrasyonu seçildi. Oksidasyon ile hasar gören MCF-7 hücrelerinin örneklerini çıkarmak için, hücre örnekleri ve süpernatanlar elde edildi ve daha önce 8-okso-dG antikorları ile kaplanmış enzim bağlantılı kuyucuklara eklendi. Numunede bulunan 8-okso-dG, katı faz taşıyıcısına bağlı antikorlara bağlanacaktır. Daha sonra yaban turpu peroksidaz ile işaretlenmiş 8-okso-dG antikorları ilave edildi. Reaksiyon karışımı, numunenin ve antikorun tam olarak bağlanmasını sağlamak için sabit bir sıcaklıkta inkübe edildi. Bağlanmamış enzim yıkanarak uzaklaştırıldı ve daha sonra mavi bir renk üreten kolorimetrik substrat eklendi. Asidin etkisi altında, çözelti sararır. Son olarak, reaksiyon kuyusu numunelerinin OD değeri 450 nm’de ölçüldü ve numunedeki 8-okso-dG konsantrasyonu OD değeri ile orantılıydı. Standart bir eğri oluşturarak, numunedeki 8-okso-dG konsantrasyonu hesaplanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
ELISA yöntemlerinin geliştirilmesi hem mevcut hem de yeni DNA hasar tespit metodolojileri için büyük önem taşımaktadır. Geleneksel HPLC ve kütle spektrometresi teknikleriyle karşılaştırıldığında, bu yaklaşım yalnızca kullanıcı dostu olmakla kalmaz, aynı zamanda yüksek hassasiyet sergiler ve yüksek verimli taramanıntaleplerini karşılar 30. Bu, büyük ölçekli hastalık tarama çalışmalarında 8-okso-dG’nin izlenmesini sağlayarak, bu biyobelirteç ile çeşitli hast…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumu Bilim ve Teknoloji için Yenilikçi Araştırma Ekibi (2021), Jiangsu Meslek Yüksekokulu Mühendislik Teknolojisi Araştırma Merkezi Programı (2023), Suzhou Halkının Geçim Teknolojisi Projeleri Anahtar Teknoloji Programı (SKY2021029), Jiangsu Klinik Kaynaklar Biyobankası Açık Projesi (TC2021B009), Radyasyon Tıbbı ve Koruma Devlet Anahtar Laboratuvarı Projesi, Soochow Üniversitesi (GZK12023013), Suzhou Mesleki Sağlık Koleji Programları (SZWZYTD202201) ve Çin’deki Jiangsu Eyaleti Qing-Lan Projesi (2021, 2022).
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA(1x) | Gibco | 25200-072 | |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo | CK04 | |
| Cell Counting Plate | QiuJing | XB-K-25 | |
| CO2 incubator | Thermo | 51032872 | |
| DMEM basic(1X) | Gibco | C11995500BT | |
| FBS | PAN | ST30-3302 | |
| GraphPad Prism X9 | GraphPad Software | statistical analysis software | |
| H2O2(3%) | Jiangxi Caoshanhu Disinfection Co.,Ltd. | 1028348 | |
| high-speed centrifuge | Thermo | 9AQ2861 | |
| Human 8-oxo-dG ELISA Kit | Zcibio | ZC-55410 | |
| L-1000XLS+ Pipettes | Rainin | 17014382 | |
| L-20XLS+ Pipettes | Rainin | 17014392 | |
| liquid nitrogen tank | Mvecryoge | YDS-175-216 | |
| MCF-7 CELL | BNCC | BNCC100137 | |
| Multiskan FC microplate photometer | Thermo | 1410101 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100X | Beyotime | C0222 | |
| Trinocular live cell microscope | Motic | 1.1001E+12 | |
| Ultra-low temperature freezer | Haire | V118574 |
References
- Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: Mechanisms, mutation, and disease. Faseb J. 17 (10), 1195-1214 (2003).
- Dizdaroglu, M., Jaruga, P. Mechanisms of free radical-induced damage to DNA. Free Radic Res. 46 (4), 382-419 (2012).
- Cadet, J., Davies, K. J. A., Medeiros, M. H., Di Mascio, P., Wagner, J. R. Formation and repair of oxidatively generated damage in cellular DNA. Free Radic Biol Med. 107, 13-34 (2017).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Jaruga, P., Dizdaroglu, M. Repair of products of oxidative DNA base damage in human cells. Nucleic Acids Res. 24 (8), 1389-1394 (1996).
- Fleming, A. M., Burrows, C. J. Chemistry of ROS-mediated oxidation to the guanine base in DNA and its biological consequences. Int J Radiat Biol. 98 (3), 452-460 (2022).
- Delaney, S., Jarem, D. A., Volle, C. B., Yennie, C. J. Chemical and biological consequences of oxidatively damaged guanine in DNA. Free Radic Res. 46 (4), 420-441 (2012).
- Wang, B., et al. Cross-sectional and longitudinal associations of acrolein exposure with pulmonary function alteration: Assessing the potential roles of oxidative DNA damage, inflammation, and pulmonary epithelium injury in a general adult population. Environ Int. 167, 107401 (2022).
- Chiorcea-Paquim, A. M. 8-oxoguanine and 8-oxodeoxyguanosine biomarkers of oxidative DNA damage: A review on HPLC-ECD determination. Molecules. 27 (5), (2022).
- He, L., Liu, X. L., Zhang, J. J. Simultaneous quantification of urinary 6-sulfatoxymelatonin and 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1095, 119-126 (2018).
- Lam, P. M., et al. Rapid measurement of 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine in human biological matrices using ultra-high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Free Radic Biol Med. 52 (10), 2057-2063 (2012).
- Machella, N., Regoli, F., Santella, R. M. Immunofluorescent detection of 8-oxo-DG and pah bulky adducts in fish liver and mussel digestive gland. Aquat Toxicol. 71 (4), 335-343 (2005).
- An, N., Fleming, A. M., White, H. S., Burrows, C. J. Nanopore detection of 8-oxoguanine in the human telomere repeat sequence. ACS Nano. 9 (4), 4296-4307 (2015).
- Xiao, S., Fleming, A. M., Burrows, C. J. Sequencing for oxidative DNA damage at single-nucleotide resolution with click-code-seq v2.0. Chem Commun (Camb). 59 (58), 8997-9000 (2023).
- Kong, W., Ji, Y., Zhu, X., Dai, X., You, C. Development and application of a chemical labeling-based biosensing assay for rapid detection of 8-oxoguanine and its repair in vitro and in human cells. Chinese J Chem. 40 (19), 2329-2334 (2022).
- Engvall, E., Perlmann, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin g. Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).
- Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. Review: Immunoassays in DNA damage and instability detection. Cell Mol Life Sci. 76 (23), 4689-4704 (2019).
- Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. J Invest Dermatol. 133 (9), e12 (2013).
- Ahirwar, R., Bhattacharya, A., Kumar, S. Unveiling the underpinnings of various non-conventional ELISA variants: A review article. Expert Rev Mol Diagn. 22 (7), 761-774 (2022).
- Li, D., et al. Magnetic nanochains-based dynamic elisa for rapid and ultrasensitive detection of acute myocardial infarction biomarkers. Anal Chim Acta. 1166, 338567 (2021).
- Tabatabaei, M. S., Islam, R., Ahmed, M. Applications of gold nanoparticles in ELISA, PCR, and immuno-pcr assays: A review. Anal Chim Acta. 1143, 250-266 (2021).
- Berlina, A. N., Zherdev, A. V., Dzantiev, B. B. ELISA and lateral flow immunoassay for the detection of food colorants: State of the art. Crit Rev Anal Chem. 49 (3), 209-223 (2019).
- Amber, K. T., Bloom, R., Hertl, M. A systematic review with pooled analysis of clinical presentation and immunodiagnostic testing in mucous membrane pemphigoid: Association of anti-laminin-332 IGG with oropharyngeal involvement and the usefulness of ELISA. J Eur Acad Dermatol Venereol. 30 (1), 72-77 (2016).
- Gervay, J., Mcreynolds, K. D. Utilization of elisa technology to measure biological activities of carbohydrates relevant in disease status. Curr Med Chem. 6 (2), 129-153 (1999).
- Tabatabaei, M. S., Ahmed, M. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Methods Mol Biol. 2508, 115-134 (2022).
- Aydin, S. A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides. 72, 4-15 (2015).
- Hayrapetyan, H., Tran, T., Tellez-Corrales, E., Madiraju, C. Enzyme-linked immunosorbent assay: Types and applications. Methods Mol Biol. 2612, 1-17 (2023).
- Eldahshoury, M. K., Hurley, I. P. Direct sandwich ELISA to detect the adulteration of human breast milk by cow milk. J Dairy Sci. 106 (9), 5908-5915 (2023).
- Tsumuraya, T., Hirama, M. Rationally designed synthetic haptens to generate anti-ciguatoxin monoclonal antibodies, and development of a practical sandwich ELISA to detect ciguatoxins. Toxins (Basel). 11 (9), 533 (2019).
- Ito, E., Iha, K., Yoshimura, T., Nakaishi, K., Watabe, S. Early diagnosis with ultrasensitive elisa). Adv Clin Chem. 101, 121-133 (2021).
- Larsson, P., Parris, T. Z. Optimization of cell viability assays for drug sensitivity screens. Methods Mol Biol. 2644, 287-302 (2023).
- Gunawardana, C. G., Diamandis, E. P. High throughput proteomic strategies for identifying tumour-associated antigens. Cancer Lett. 249 (1), 110-119 (2007).
- Zhang, S., et al. Development of a das-ELISA for gyrovirus homsa1 prevalence survey in chickens and wild birds in China. Vet Sci. 10 (5), 312 (2023).
- Li, Y., Sun, J., Shang, H. Effect of hogg1 expression level on oxidative DNA damage among workers exposed to nickel in stainless steel production environment. Zhonghua Lao Dong Wei Sheng Zhi Ye Bing Za Zhi. 32 (8), 578-581 (2014).
