Quantificando o nível de 8-oxo-dG usando o ensaio ELISA para avaliar o dano oxidativo ao DNA em células MCF-7

O dano oxidativo do DNA é consequência de um desequilíbrio entre a geração de espécies reativas de oxigênio (EROs) e o sistema de defesa antioxidante celular¹. Envolve principalmente a oxidação de bases de DNA purina e pirimidina ^2,3. Essa modificação oxidativa das bases do DNA não apenas compromete a integridade do genoma, mas também abrange uma ampla gama de problemas patológicos, incluindo câncer, doenças neurodegenerativas e doenças cardiovasculares ^4,5. A base guanina no DNA tem o menor potencial de redução e é a mais suscetível à oxidação⁶. Portanto, a 8-oxo-7,8-dihidro-2′-desoxiguanosina (8-oxo-dG) serve como um marcador primário para avaliar a extensão do dano oxidativo do DNA ^7,8. A quantificação precisa de 8-oxo-dG tornou-se uma questão crítica na abordagem de vários aspectos da ocorrência da doença, progressão e avaliação da carga oxidativa multifatorial⁹.

Os métodos tradicionais de detecção de 8-oxo-dG, como cromatografia líquida de alta eficiência com detecção eletroquímica (HPLC-ECD), espectrometria de massa e técnicas hifenizadas relacionadas, exibem alta sensibilidade e especificidade 10,11,12. No entanto, essas técnicas geralmente têm requisitos operacionais complexos e altos custos, o que dificulta sua ampla aplicabilidade e praticidade na análise de amostras de alto rendimento. Com o avanço contínuo da ciência e da tecnologia, surgiu uma variedade de métodos novos, eficientes e precisos. A aplicação dessas novas tecnologias nos permite quantificar o nível de 8-oxo-dG com mais precisão e fornece ferramentas mais poderosas para um estudo aprofundado da associação entre estresse oxidativo e doença. Por exemplo, os pesquisadores aplicaram a tecnologia de nanoporos para detectar e sequenciar quantitativamente o DNA¹³, identificar tipos de danos ao DNA usando uma estratégia de sequenciamento de código com um único clique¹⁴, desenvolver métodos de sequenciamento de alto rendimento e criar biossensores baseados em 8-oxoG integrando biotina-estreptavidina com ELISA¹⁵. Entre eles, o ELISA, com suas vantagens reconhecidas em termos de especificidade, triagem de alto rendimento e custo, é uma das soluções ideais para a detecção de 8-oxo-dG. Portanto, é crucial desenvolver um método de alto rendimento, altamente sensível, conveniente e rápido para detectar 8-oxo-dG.

A técnica de ensaio imunoenzimático (ELISA), desenvolvida em 1971¹⁶, avançou rapidamente nos últimos 50 anos e tornou-se um dos métodos de detecção mais comumente usados nas áreas de biologia e medicina 17,18,19. A tecnologia ELISA exibe alta sensibilidade e especificidade, possui um tempo de reação curto e é fácil de usar, tornando-a uma escolha amplamente reconhecida para testes de amostras em larga escala e análise de alto rendimento²⁰. Como resultado, o ELISA tem sido amplamente utilizado para análise quantitativa ou semiquantitativa de compostos, proteínas, anticorpos ou moléculas dentro das células 21,22,23. Por exemplo, tem sido utilizado na detecção de biomarcadores associados a várias doenças, resíduos de drogas e biomoléculas²⁴. Os ELISAs podem ser categorizados em quatro tipos principais com base no desenho experimental e nos princípios²⁵. Esses métodos incluem ELISA direto, ELISA indireto, ELISA sanduíche e ELISA competitivo^26,27. Dentre estes, o ELISA sanduíche, que utiliza dois anticorpos específicos, um para capturar a molécula alvo e outro para detecção, foi escolhido para o estudo neste artigo. O princípio experimental do ELISA sanduíche é o seguinte: Primeiro, um anticorpo específico é imobilizado nos poços de uma microplaca para capturar o analito de interesse. Depois que o padrão ou amostra é adicionado, o analito alvo se liga ao anticorpo imobilizado. Posteriormente, um anticorpo marcado que reconhece um epítopo diferente no antígeno é adicionado, formando uma estrutura sanduíche. Após a remoção de anticorpos não ligados, um substrato é adicionado. Sob a ação catalítica do anticorpo secundário, ocorre uma reação de cor e a intensidade da cor é positivamente correlacionada com a concentração do analito alvo na amostra. Por fim, a densidade óptica (DO) foi medida para determinar a concentração da amostra. O ELISA sanduíche tem as vantagens de aumentar a sensibilidade e especificidade para amostras-alvo, o que o torna adequado para detectar baixas concentrações de analitos alvo e amostras complexas²⁸. Além disso, os resultados obtidos podem ser quantificados para análise posterior. Esses fatores tornam o ELISA sanduíche um método de detecção comumente usado tanto em pesquisas científicas quanto em laboratórios clínicos²⁹.

Este estudo teve como objetivo detectar quantitativamente 8-oxo-dG em células MCF-7 para determinar o grau de dano oxidativo do DNA nas células. Este estudo consiste em duas partes principais: construir um modelo de dano oxidativo do DNA da célula MCF-7 e detectar 8-oxo-dG usando ELISA. Primeiramente, as células MCF-7 foram cultivadas in vitro e tratadas com diferentes concentrações de H₂O₂ por diferentes durações. A viabilidade celular foi avaliada usando um ensaio CCK-8 para determinar a concentração inibitória semimáxima (IC₅₀) de H₂O₂ em células MCF-7. Com base nos valores de IC₅₀ , um tempo de tratamento H₂O₂ adequado e concentração de indução foram escolhidos. Para extrair amostras de células MCF-7 danificadas por oxidação, amostras de células e sobrenadantes foram obtidos e adicionados a poços ligados a enzimas previamente revestidos com anticorpos 8-oxo-dG. O 8-oxo-dG presente na amostra se ligará aos anticorpos ligados ao transportador de fase sólida. Em seguida, foram adicionados anticorpos 8-oxo-dG marcados com peroxidase de rábano. A mistura de reação foi incubada a uma temperatura constante para garantir a ligação completa da amostra e do anticorpo. A enzima não ligada foi removida por lavagem e, em seguida, o substrato colorimétrico foi adicionado, o que produziu uma cor azul. Sob a ação do ácido, a solução ficou amarela. Finalmente, o valor de DO das amostras de poço de reação foi medido a 450 nm, e a concentração de 8-oxo-dG na amostra foi proporcional ao valor de DO. Ao gerar uma curva padrão, a concentração de 8-oxo-dG na amostra pode ser calculada.