Summary

Quantifizierung des 8-Oxo-dG-Gehalts mittels ELISA-Assay zur Bewertung oxidativer DNA-Schäden in MCF-7-Zellen

Published: May 24, 2024
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Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente Methode zum quantitativen Nachweis oxidativer DNA-Schäden in MCF-7-Zellen mittels ELISA-Technologie.

Abstract

Die 8-Oxo-7,8-dihydro-2′-desoxyguanosin-Base (8-oxo-dG) ist die vorherrschende Form der häufig beobachteten oxidativen DNA-Schädigung. DNA-Beeinträchtigungen wirken sich tiefgreifend auf die Genexpression aus und sind ein entscheidender Faktor bei der Stimulierung neurodegenerativer Erkrankungen, Krebs und Alterung. Daher ist die präzise Quantifizierung von 8-OxoG von klinischer Bedeutung bei der Untersuchung von Methoden zum Nachweis von DNA-Schäden. Gegenwärtig stellen die bestehenden Ansätze zum 8-OxoG-Nachweis jedoch Herausforderungen in Bezug auf Komfort, Zweckmäßigkeit, Erschwinglichkeit und erhöhte Empfindlichkeit dar. Wir verwendeten die ELISA-Technik (Sandwich Enzyme-linked Immunosorbent Assay), eine hocheffiziente und schnelle kolorimetrische Methode, um Variationen des 8-Oxo-dG-Gehalts in MCF-7-Zellproben zu erkennen, die mit unterschiedlichen Konzentrationen von Wasserstoffperoxid (H2O2) stimuliert wurden. Wir bestimmten die Konzentration von H2O2 , die oxidative Schäden in MCF-7-Zellen induzierte, indem wir ihren IC50-Wert in MCF-7-Zellen detektierten. Anschließend behandelten wir MCF-7-Zellen 12 h lang mit 0, 0,25 und 0,75 mM H2O2 und extrahierten 8-Oxo-dG aus den Zellen. Abschließend wurden die Proben einem ELISA unterzogen. Nach einer Reihe von Schritten, einschließlich Plattenspreizung, Waschen, Inkubation, Farbentwicklung, Beendigung der Reaktion und Datenerfassung, konnten wir erfolgreich Veränderungen des 8-Oxo-dG-Gehalts in MCF-7-Zellen nachweisen, die durch H2O2 induziert wurden. Durch diese Bestrebungen wollen wir eine Methode zur Bewertung des Ausmaßes oxidativer DNA-Schäden in Zellproben etablieren und damit die Entwicklung von zweckmäßigeren und bequemeren Ansätzen zur Detektion von DNA-Schäden vorantreiben. Dieses Unterfangen ist bereit, einen bedeutenden Beitrag zur Erforschung assoziativer Analysen zwischen oxidativen DNA-Schäden und verschiedenen Bereichen zu leisten, einschließlich der klinischen Forschung zu Krankheiten und dem Nachweis toxischer Substanzen.

Introduction

Die oxidative Schädigung der DNA ist die Folge eines Ungleichgewichts zwischen der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und dem zellulären antioxidativen Abwehrsystem1. Es handelt sich hauptsächlich um die Oxidation von DNA, Purin und Pyrimidinbasen, 2,3. Diese oxidative Modifikation der DNA-Basen beeinträchtigt nicht nur die Integrität des Genoms, sondern umfasst auch ein breites Spektrum pathologischer Probleme, darunter Krebs, neurodegenerative Erkrankungen und Herz-Kreislauf-Erkrankungen 4,5. Die Guaninbase in der DNA hat das geringste Reduktionspotenzial und ist am anfälligsten für Oxidation6. Daher dient 8-Oxo-7,8-dihydro-2′-desoxyguanosin (8-oxo-dG) als primärer Marker zur Beurteilung des Ausmaßes der oxidativen Schädigung der DNA 7,8. Die genaue Quantifizierung von 8-Oxo-dG ist zu einem kritischen Thema geworden, wenn es darum geht, verschiedene Aspekte des Auftretens, des Fortschreitens und der Bewertung der multifaktoriellen oxidativen Belastungzu behandeln 9.

Die traditionellen Methoden zum Nachweis von 8-Oxo-dG, wie z. B. die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit elektrochemischer Detektion (HPLC-ECD), die Massenspektrometrie und verwandte Bindestrichtechniken, weisen eine hohe Sensitivität und Spezifität auf 10,11,12. Diese Techniken sind jedoch oft mit komplexen betrieblichen Anforderungen und hohen Kosten verbunden, was ihre breite Anwendbarkeit und Praktikabilität in der Hochdurchsatz-Probenanalyse behindert. Mit der kontinuierlichen Weiterentwicklung von Wissenschaft und Technologie ist eine Vielzahl neuer, effizienter und genauer Methoden entstanden. Die Anwendung dieser neuen Technologien ermöglicht es uns, den 8-Oxo-dG-Gehalt genauer zu quantifizieren und leistungsfähigere Werkzeuge für eine eingehende Untersuchung des Zusammenhangs zwischen oxidativem Stress und Krankheit bereitzustellen. So haben Forscher beispielsweise die Nanoporentechnologie eingesetzt, um DNA13 quantitativ nachzuweisen und zu sequenzieren, DNA-Schadenstypen mit einer Single-Click-Code-Sequenzierungsstrategie14 zu identifizieren, Hochdurchsatz-Sequenzierungsmethoden zu entwickeln und 8-OxoG-basierte Biosensoren durch Integration von Biotin-Streptavidin in ELISAherzustellen 15. Unter ihnen ist ELISA mit seinen anerkannten Vorteilen in Bezug auf Spezifität, Hochdurchsatz-Screening und Kosten eine der idealen Lösungen für den 8-Oxo-dG-Nachweis. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, eine hochempfindliche, komfortable und schnelle Methode mit hohem Durchsatz zum Nachweis von 8-Oxo-dG zu entwickeln.

Die 197116 entwickelte ELISA-Technik (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) hat sich in den letzten 50 Jahren rasant weiterentwickelt und ist heute eine der am häufigsten verwendeten Nachweismethoden in den Bereichen Biologie und Medizin 17,18,19. Die ELISA-Technologie weist eine hohe Sensitivität und Spezifität auf, verfügt über eine kurze Reaktionszeit und ist einfach zu bedienen, was sie zu einer weithin anerkannten Wahl für groß angelegte Probentests und Hochdurchsatzanalysen macht20. Infolgedessen wurde ELISA in großem Umfang für die quantitative oder semiquantitative Analyse von Verbindungen, Proteinen, Antikörpern oder Molekülen in Zellen verwendet 21,22,23. Zum Beispiel wurde es bei der Detektion von Biomarkern eingesetzt, die mit verschiedenen Krankheiten, Arzneimittelrückständen und Biomolekülen assoziiert sind24. ELISAs können auf der Grundlage des Versuchsdesigns und der Prinzipien in vier Haupttypen eingeteilt werden25. Zu diesen Methoden gehören der direkte ELISA, der indirekte ELISA, der Sandwich-ELISA und der kompetitive ELISA26,27. Unter diesen wurde für die Studie in dieser Arbeit der Sandwich-ELISA ausgewählt, der zwei spezifische Antikörper verwendet, einen für das Einfangen des Zielmoleküls und einen für den Nachweis. Das experimentelle Prinzip des Sandwich-ELISA ist wie folgt: Zuerst wird ein spezifischer Antikörper in den Vertiefungen einer Mikroplatte immobilisiert, um den interessierenden Analyten einzufangen. Nachdem der Standard oder die Probe hinzugefügt wurde, bindet der Zielanalyt an den immobilisierten Antikörper. Anschließend wird ein markierter Antikörper hinzugefügt, der ein anderes Epitop auf dem Antigen erkennt, wodurch eine Sandwichstruktur gebildet wird. Nach der Entfernung der ungebundenen Antikörper wird ein Substrat hinzugefügt. Unter der katalytischen Wirkung des Sekundärantikörpers tritt eine Farbreaktion auf, und die Intensität der Farbe korreliert positiv mit der Konzentration des Zielanalyten in der Probe. Abschließend wurde die optische Dichte (OD) gemessen, um die Konzentration der Probe zu bestimmen. Der Sandwich-ELISA hat die Vorteile einer erhöhten Sensitivität und Spezifität für Zielproben, wodurch er für den Nachweis niedriger Konzentrationen von Zielanalyten und komplexen Proben geeignet ist28. Darüber hinaus können die erzielten Ergebnisse für die weitere Analyse quantifiziert werden. Diese Faktoren machen den Sandwich-ELISA zu einer häufig verwendeten Nachweismethode sowohl in der wissenschaftlichen Forschung als auch in klinischen Laboratorien29.

Ziel dieser Studie war es, 8-Oxo-dG in MCF-7-Zellen quantitativ nachzuweisen, um den Grad der oxidativen DNA-Schädigung in den Zellen zu bestimmen. Diese Studie besteht aus zwei Hauptteilen: der Konstruktion eines MCF-7-Zell-DNA-Modells für oxidative Schäden und dem Nachweis von 8-Oxo-dG mittels ELISA. Zunächst wurden MCF-7-Zellen in vitro kultiviert und mit unterschiedlichen Konzentrationen von H2O2 für unterschiedliche Zeiträume behandelt. Die Zellviabilität wurde mit einem CCK-8-Assay untersucht, um die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) von H2O2 in MCF-7-Zellen zu bestimmen. Basierend auf den IC50-Werten wurde eine geeignete H2O2 -Behandlungszeit und Induktionskonzentration gewählt. Um Proben von MCF-7-Zellen zu extrahieren, die durch Oxidation geschädigt wurden, wurden Zellproben und Überstände entnommen und in enzymverknüpfte Vertiefungen gegeben, die zuvor mit 8-Oxo-dG-Antikörpern beschichtet waren. Das in der Probe vorhandene 8-Oxo-dG bindet an die Antikörper, die an den Festphasenträger gebunden sind. Dann wurden 8-Oxo-dG-Antikörper hinzugefügt, die mit Meerrettichperoxidase markiert waren. Das Reaktionsgemisch wurde bei konstanter Temperatur inkubiert, um eine vollständige Bindung der Probe an den Antikörper zu gewährleisten. Das ungebundene Enzym wurde durch Waschen entfernt, und dann wurde das kolorimetrische Substrat hinzugefügt, das eine blaue Farbe erzeugte. Unter Einwirkung von Säure färbte sich die Lösung. Schließlich wurde der OD-Wert der Reaktionstopfproben bei 450 nm gemessen, und die Konzentration von 8-Oxo-dG in der Probe war proportional zum OD-Wert. Durch die Erstellung einer Standardkurve kann die Konzentration von 8-Oxo-dG in der Probe berechnet werden.

Protocol

1. Aufbau eines H2O2 -induzierten DNA-oxidativen Schadensmodells in MCF-7-Zellen Rückgewinnung von MCF-7-ZellenDas Kryoröhrchen für die Zellkultur, das 3,5 x 106 MCF-7-Zellen enthält und in einem -80 °C-Kühlschrank gelagert wird, wird schnell in eine Schaumstoffbox mit flüssigem Stickstoff umgefüllt. Nehmen Sie den Schlauch mit einer Pinzette heraus und legen Sie ihn für ca. 1 min in ein Wasserbad mit konstanter Temperatur bei 3…

Representative Results

Wie in Abbildung 3 dargestellt, zeigt die X-Achse die Konzentration von H2O2 an, die auf MCF-7-Zellen aufgebracht wird, während die Y-Achse die Lebensfähigkeit der Zellen anzeigt. Die Behandlung mit 0,75 mM für 12 h reduzierte die Lebensfähigkeit der MCF-7-Zellen auf 67%. Gleichzeitig mit dem Konzentrationsanstieg kam es zu einer signifikanten Abnahme der Lebensfähigkeit von MCF-7-Zellen, insbesondere bei einer Konzentration von 1,5 mM, wo die Lebensfähigkeit auf …

Discussion

Die Entwicklung von ELISA-Methoden ist sowohl für bestehende als auch für neue Methoden zum Nachweis von DNA-Schäden von großer Bedeutung. Im Vergleich zu herkömmlichen HPLC- und Massenspektrometrie-Techniken ist dieser Ansatz nicht nur benutzerfreundlich, sondern weist auch eine hohe Sensitivität auf und erfüllt die Anforderungen des Hochdurchsatz-Screenings30. Dies ermöglicht das Monitoring von 8-Oxo-dG in groß angelegten Krankheitsscreening-Studien und ermöglicht ein tieferes Verstän…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt durch das innovative Forschungsteam für Wissenschaft und Technologie der Jiangsu Higher Education Institution (2021), das Programm des Jiangsu Vocational College Engineering Technology Research Center (2023), das Schlüsseltechnologieprogramm der Suzhou People’s Livelihood Technology Projects (SKY2021029), das offene Projekt der Jiangsu Biobank of Clinical Resources (TC2021B009), das Projekt des State Key Laboratory of Radiation Medicine and Protection, Soochow University (GZK12023013), Programme des Suzhou Vocational Health College (SZWZYTD202201) und Qing-Lan Project der Provinz Jiangsu in China (2021, 2022).

Materials

0.25% Trypsin-EDTA(1x) Gibco 25200-072
Cell Counting Kit-8 Dojindo CK04
Cell Counting Plate QiuJing XB-K-25
CO2 incubator Thermo 51032872
DMEM basic(1X) Gibco C11995500BT
FBS PAN ST30-3302
GraphPad Prism X9 GraphPad Software statistical analysis software
H2O2(3%) Jiangxi Caoshanhu Disinfection Co.,Ltd. 1028348
high-speed centrifuge Thermo  9AQ2861
Human 8-oxo-dG ELISA Kit Zcibio ZC-55410
L-1000XLS+ Pipettes Rainin 17014382
L-20XLS+ Pipettes Rainin 17014392
liquid nitrogen tank Mvecryoge YDS-175-216
MCF-7 CELL BNCC BNCC100137
Multiskan FC microplate photometer Thermo 1410101
PBS Solarbio P1020
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X Beyotime C0222
Trinocular live cell microscope Motic 1.1001E+12
Ultra-low temperature freezer Haire V118574

References

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Nian, L., Li, X., Du, J., Liu, S. Quantifying the Level of 8-oxo-dG Using ELISA Assay to Evaluate Oxidative DNA Damage in MCF-7 Cells. J. Vis. Exp. (207), e66888, doi:10.3791/66888 (2024).

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