Büyüme Plakası Yaralanmasını İncelemek için Üç Renkli Transgenik Murin Modeli

Araştırma, kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm hayvan prosedürleri, çalışmaya başlamadan önce Connecticut Üniversitesi Sağlık Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Protokolün bir taslağı Şekil 1 şemasında açıklanmıştır. Şekil 1: Üç renkli kollajen raportör farelerde büyüme plakası yaralanma protokolünün ana hatları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 1. Fare yetiştiriciliği ve ameliyata hazırlık 2 haftalık (± 1 gün) ameliyat için yavrular elde etmek için standart yetiştirme prosedürlerine göre Col1a1-GFPTpz, Col2a1-CFP ve Col10a1-mCherry 16,17,18,19,20,21 eksprese eden üç renkli transgenik kollajen raportör fareler yetiştirin. Bir floresan mikroskobu altında bir kuyruk ucu parçasını genotipleyerek üçlü transgen ekspresyonunu doğrulayın. Sonraki histolojik analiz sırasında raportör sisteminin faydasını en üst düzeye çıkarmak için yalnızca üç renk için de pozitif olan fareleri kullanın.NOT: Bu 2 haftalık yaş (± 1 gün), kemik büyüme plakaları insan ergen22 ile benzer bir gelişim aşamasında olduğu için seçilmiştir. Bu protokol farelerin her iki cinsiyeti için de geçerlidir. Ameliyat günü veya bir gün önce, kulağı ve kulak yumruğunu alkollü antiseptik pedlerle dezenfekte ettikten sonra bir kulak yumruğu kullanarak ameliyat için kullanılan her fareyi benzersiz bir şekilde tanımlayın, her fareyi tartın ve değeri kaydedin. Fare izofluran anestezisinin etkisi altındayken sağ arka bacak kalçadan ayağa kadar tüm sağ bacak tıraş edin. Farelerde anesteziyi indüklemek için, 1-2 L’lik bir indüksiyon odası içinde 1 L / dak’lık bir akış hızında uygulanan izofluran (% 2-3) ve% 100 oksijen karışımı kullanın. Fareyi çıkarın ve farenin hareket etmesine neden olmaması gereken bir ayak parmağı tutamıyla anestezi derinliğinin yeterli olduğunu onaylayın.NOT: Bu anestezi derinliği, anestezi burun konisi gerektirmeden tıraşı gerçekleştirmek için yeterince uzun sürecektir. İlk uzuv uzunluğunu kaydetmek için izofluran kaynaklı anestezi altında canlı farelerde tibial görüntüleri yakalamak için 26 kV (800 mA) güç ayarlı X-ışını görüntülemesi kullanın.Fareleri X-ışını kabinine yerleştirmeden önce, 1-2 L’lik bir indüksiyon odası içinde 1 L / dk’lık bir akış hızında uygulanan izofluran (% 2-3) ve% 100 oksijen karışımı kullanarak derin bir anestezi durumu indükleyin. Anestezi uygulanmış üç fareyi, üç fareyi de içeren bir görüntünün elde edilmesini sağlayan bir raf yüksekliğinde, X-ışını kabinine mideleri üzerine paralel olarak yerleştirin. Bacakları yayın, böylece tibial kemikler farenin altında gizlenmez. Gelişmiş ölçüm doğruluğu için, görüntüleme sırasında farenin yanına bir radyoopak ölçek yerleştirin (Şekil 2A). Hazırlanan fareleri, sonraki cerrahi prosedürleri beklemek için anne fare ile birlikte yuva kafeslerine geri koyun. 2. Cerrahi malzemelerin ve steril çalışma alanının hazırlanması Aşağıdaki öğeleri sterilize edin: 10-20 gazlı bez, pamuk uçlu aplikatör çubukları, diş frezleri (0,5 mm çap), diş başlıkları, Graefe forsepsleri, kavisli sivrisinek hemostatik forsepsleri, kavisli ince makaslar, iğne tutucular, periodontal problar ve diş cleoid diskoid oymacıları. Gerekli ek steril malzemeleri toplayın: enjekte edilebilir bir buprenorfin süspansiyonu, 20 G iğneler, 1 mL şırıngalar, havlu örtüleri, 5-0 boyasız, örgülü, kaplamalı, vicryl sütürler, povidon-iyot, fosfat tamponlu salin, alkol antiseptik pedler, # 15 neşter, cerrahi eldivenler, çevresel yüzey bariyer tüpü sox, göz kayganlaştırıcı,% 70 etanol sprey. Ameliyat sırasında öğelerin ek sterilizasyonu için bir cam boncuk sterilizatörünü ve sterilize yataklı temiz bir fare kafesinin altında elektrikli ısıtma yastığını açın. Floresan stereomikroskop aşamasını, bitişik yüzeyleri ve cerrahi alet standını etanol kullanarak temizleyin ve sterilize edin. Ameliyat çalışma alanı haline gelecek olan bu bölgelerin üzerini steril havlu örtüler ile örtün. Elektronik yüksek hızlı diş delme sistemini monte edin. Elektronik ayak kumandasını kontrol ünitesine bağlayın ve başlık kablosunu dezenfekte edilmiş bir yüzey bariyer tüpü sox ile kapatın. Steril 0,5 mm yuvarlak diş frezini takın. Denetleyiciyi açın ve 1:1 sürücü oranına ve maksimum 30.000 rpm’ye ayarlayın. Floresan stereomikroskop aşamasında dezenfekte edilmiş bir yüzey bariyer tüpü sox ile kaplanmış burun konisi ile sonlanan esnek izofluran makine hortumunu bantla sabitleyin. Floresan stereomikroskobu ve yardımcı ekipmanı açın ve görüntü alma yazılımını açın. Şekil 2: Trilineage floresan raportör murin büyüme plakası yaralanma prosedürünün temel adımları. (A) X-ışını kabininde farelerin yanına yerleştirilmiş bir radyoopak cetvel kullanılarak faksitron X-ışını görüntüleme ile tibial uzunluğun ölçülmesi. (B) Floresan stereomikroskop altında ameliyat için anestezi uygulanmış bir farenin uygun pozisyonu. Proksimal tibia siyah bir okla gösterilir. (C) Büyüme plakasına erişmek için yapılan bir kesi örneği. (D) Büyüme plakasının hipertrofik bölgesini aydınlatan floresan stereo mikroskobu (beyaz ok). Bitişik proliferatif bölge sarı bir okla gösterilir. (E) 0,5 mm’lik diş frezini büyüme plakasına yerleştiren cerrahın parlak ışık aydınlatması. (F) Dental frezin hassas yerleştirilmesi, floresan stereo mikroskobu ile hipertrofik bölgeye yönlendirilir. (G) Salter-Harris Tip II benzeri büyüme plakası defekti örneği (beyaz ok). Ölçek çubukları = 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 3. Proksimal tibia büyüme plakası yaralanma prosedürü Fareyi izofluran anestezi odasında uyuşturun, izofluran konsantrasyonunu% 2-3’e ve oksijen akış hızını 1 L / dk’ya ayarlayın. Ayak parmağı sıkışma testi ve solunum paternlerinin gözlemlenmesi ile doğrulanan derin bir anestezik durumun indüksiyonunu bekleyin. Farenin hazneden çıkarılmasından hemen sonra reçete edilen buprenorfin dozunun yarısını deri altına uygulayın. Buprenorfin dozu, onaylanmış hayvan protokolüne göre yapılır. Ameliyat sırasında farenin gözlerinin kurumasını önlemek için oküler kayganlaştırıcı uygulayın ve fareyi sırtüstü pozisyonda stereomikroskop aşamasındaki izofluran makinesi burun konisine aktarın (Şekil 2B). Burun konisinden geçen anestezi akışını %2’ye ve oksijen akış hızını 1 L/dk’ya ayarlayın. Sağ arka bacak, pelvik bölge, sol arka bacak ön yüzü ve kuyruğu sırayla povidon-iyot ve ardından% 70 etanol ile dezenfekte edin. Ameliyata başlamadan önce ek bir ayak parmağı sıkıştırma testi ve solunum paternlerinin gözlemlenmesi yoluyla devam eden stabil bir anestezi derinliğini doğrulayın. Parlak ışık aydınlatması altında, sağ tibianın proksimal ucunu ortaya çıkarmak için diz ekleminin hemen altındaki deride başlangıç uzunluğu yaklaşık 5 mm olan bir kesi oluşturmak için #15 neşter kullanın (Şekil 2C). Gerekirse kesimi uzatmak için makas kullanın. Sol kontralateral tibiayı yaralanmamış halde tutun, böylece iç yaralanmamış kontrol görevi görür. # 15 neşterinin arka tarafını kullanarak proksimal tibiadaki üstteki kas boyunca dikey bir künt diseksiyon yapın ve büyüme plakasının net bir şekilde ortaya çıkması için yumuşak dokuyu çıkarın. Ameliyathane ışıklarını kapatın ve büyüme plakasının istenen bölgesini aydınlatmak için doğru floresan kanalını seçin. Floresan kollajenlerin her birini görüntülemek için gereken filtre setleri Col 2 Cyan: ET436 / 20x (uyarma), ET480 / 40 m (emisyon), Col 10 mCherry: ET577 / 20x (uyarma), ET640 / 40 m (emisyon), Col 1 Topaz: ET500 / 20x (uyarma), ET535 / 30 m (emisyon). Proksimal tibial büyüme plakasını gözlemlemek için fareyi konumlandırın (Şekil 2D). Femur büyüme plağının değil, tibial büyüme plağının göründüğünden emin olmak için cilt açıklığını biraz daha proksimal ve ardından distal olarak ayarlayın. Mikroskop göz merceğinden bakarken, 0.5 mm’lik dental matkap frezini hipertrofik büyüme plakası bölgesinin ortasında tibial eksene paralel olarak konumlandırarak lateral bir yaklaşım kullanarak Salter-Harris Tip II benzeri bir lezyon oluşturun (Şekil 2E,F). Salter-Harris Tip II lezyonunu taklit eden bir kusuru tekrarlanabilir bir şekilde yapmak için, uzuvu çalışma yüzeyine paralel tutun, böylece frez giriş yolu epifize açı yapmaz. Frez dönüşünü başlatmak için matkap pedalına baskı uygulayın ve kusur frez çapından daha derine inmeden önce frezi büyüme plakasına hafifçe bastırın (Şekil 2G).NOT: Fare uzuvunu stabilize etmeye yardımcı olan ikinci bir çift el yardımcı olur. Herhangi bir kalıntıyı temizlemek için lezyon bölgesini bir damla steril PBS ile sulayın. Bir periodontal prob kullanarak kusurun derinliğini 0,5 mm’de onaylayın. 4. Yaralanma sonrası prosedürler ve kapatma Sıfır zaman kusur karakterizasyonu için, doku kapanmadan önce yaralı arka uzuv ve kontrol uzuvunu hasat edin. Bölüm 6’da doku toplamayı ve sonraki mikrobilgisayarlı tomografi (mikroBT) ve kriyo-histoloji görüntülemesi için hazırlığı takip edin.NOT: Büyüme plakası defektine terapötik bir maddenin implantasyonunu içeren deneyler için, defektin kendisi yalnızca kabaca küresel ve 0,5 mm çapında veya 0,082 mm3 (0,082 μL) hacminde bir biyomateryal parçasını barındırabilir. Biyomateryali yerleştirmek veya büyüme plakası içindeki kusura sıvı bir terapötik enjekte etmek için mikroskobik görselleştirme altında forseps kullanın. Çalışma tasarımı, terapötiğin sadece kusurla sınırlı olmasını gerektirmiyorsa, daha büyük miktarda biyomateryal veya enjekte edilen madde kullanın. Cilt kenarlarını dikkatlice yeniden hizalayın, eğer varsa, implante edilen materyalin kusur bölgesi içinde güvenli bir şekilde kalmasını sağlayın. Cilt kesisini etkili bir şekilde kapatmak için 5-0 poliglikolik asit sütürlerle kesintili dikiş teknikleri kullanın. Steril su ile bezler kullanarak povidon-iyot kalıntısının cerrahi bölgesinin dışındaki alanları iyice temizleyin, yara ve yakın çevredeki alanlarla temastan kaçınmaya özen gösterin. Fareyi mikroskop tablasındaki izofluran burun konisinden bir kurtarma kafesine çıkarın ve bir ısıtma yastığı üzerinde taze yatak örtüsü üzerine yanal olarak yerleştirin. Farenin solunum hızını yaklaşık 5 dakika boyunca yakından gözlemleyin, izofluran anestezisinin etkileri azaldığında, solunum hızında bir artışla gösterilirken, ancak hareketliliğin başlamasından önce analjezi için kalan buprenorfin dozunu uygulayın. Fareyi, tam yürüme yeteneklerini gösterene kadar izole bir kurtarma kafesinde tutun, daha sonra annesi ve kardeşleriyle yeniden bir araya getirin. Ameliyattan sonraki ilk 48 saat için günlük denetimler yapın, ardından ötenazi noktasına kadar haftalık değerlendirmeler yapın. Enfeksiyon belirtilerine, hareket etkinliğine, yiyeceğe erişilebilirliğe ve dikişlerin bütünlüğüne odaklanın. Fareleri standart zamanda (yani 3 haftalıkken) sütten kesin. 5. Uzuv uzunluğu ölçümleri Deneysel hipotez ve tasarım tarafından belirlenen zaman noktalarına dayanarak, fareleri izofluran ile uyuşturun ve Şekil 2A’da gösterildiği ve bölüm 1.4’te açıklandığı gibi hem yaralı hem de yaralanmamış tibiaların tam uzunluğunun X-ışını görüntülemesini yapın. Tutarlı uzuv uzunluğu ölçümleri yapmak için uygun yer işaretleri, Şekil 3’te gösterildiği gibi tibial epifizin üst kısmını ve tibiotalar eklemdeki tibianın distal ucunu içerir.NOT: Görüntüleme, yaralanmaya bağlı uzuv uzunluğu ve uzuv uzunluğu farklılıklarının yanı sıra belirli postoperatif aralıklarla büyüme plakası dokuları içindeki kemikli köprünün gelişimini değerlendirmek için kullanılır. 6. Doku diseksiyonu, fiksasyon, mikroCT görüntüleme ve gömme Fareyi CO2 boğulması yoluyla, tercihen servikal çıkık gibi alternatif bir yöntemle ölüm onayı ile otomatik bir CO2 indüksiyon sistemi kullanarak ötenazi yapın. Histolojik ve mikroCT analizine hazırlanırken her iki sağlam arka uzuvları izole edin ve kemik ve diz kapsüler bölgesinden deri ve kasları çıkarın.Arka bacakları fiksatife koymadan önce, diz boşluğuna fiksatif penetrasyonu kolaylaştırmak için mikro diseksiyon makası kullanarak patellayı dikkatlice keserek çıkarın. Soğuk% 10 tamponlu formalini diz boşluğunun tüm bölgelerine iyice dağıtmak için 29 G’lık bir insülin şırıngası kullanın. İlik boşluğuna fikratif erişimi iyileştirmek için femur ve tibianın diyafiz bölgesini şiddetlendirin. Eklem dokusunu fiksatif içinde 4 ° C’de 24-36 saat boyunca ince bir dübelin üzerine gazlı bezle bağlayarak tamamen uzatılmış bir konumda tutun.DİKKAT: Formalin toksiktir ve uygun kişisel koruyucu ekipman giyilirken çeker ocak içinde kullanılmalıdır. 4 ° C’de 24-48 saat formalin fiksasyonundan sonra, kemik köprüsü gelişiminin değerlendirilmesi için numuneleri PBS’ye aktardıktan sonra mikroCT görüntüleme ile kontralateral ve yaralı numunelerin yüksek çözünürlüklü X-ışını mikroBT’sini gerçekleştirin. 6,0 μm’lik bir voksel boyutu, 330.000 ms’lik örnekleme süreleri ve 145 μA yoğunlukta 55.000 V’luk enerji ayarları kullanın. MikroCT görüntülemeden ve 4 ° C’de 24 saatlik ek bir formalin fiksasyonundan sonra, numuneleri 1X PBS’de 3 x 5 dakika durulayın ve ardından numuneleri 1 saat boyunca 1X PBS’de sükroza, 1X PBS’de sükroz içine daldırın 1 saat ve gece boyunca 1X PBS’de% 30 sükroz. Sükroz solüsyonunun tüm diz boşluğu bölgelerine nüfuz etmesini sağlamak için sükroz solüsyonu ile doldurulmuş 29 G’lik bir insülin şırıngası kullanın. GFP raportörünün ve doku enzimatik aktivitesinin korunmasını sağlamak için gece boyunca sükroz daldırıldıktan sonra gömülmeyecekse -80 °C’lik bir dondurucuya aktarın. Gömmeden önce eklem bölgesinde kalan kas dokusunu çıkarın. Numuneyi gece boyunca kriyo gömülü bir ortamla dengeleyin ve ortamın diz boşluğuna nüfuz etmesini kolaylaştırın. Gömmeden önce defektin ve kemik köprüsünün nerede olduğunu belirlemek için mikroCT görüntülerini görüntüleyin. Kriyo gömme ortamının ince bir tabakasını bir kriyokalıba uygulayın ve disseke edilmiş ve hala bağlı olan tibia/femur/eklemi, ilgilenilen bölge gömme ortamının yüzeyine 90° bakacak şekilde yerleştirin.NOT: Bu yönlendirme, kesitlemenin yanal olarak oluşturulan kusurun yanal görünümünü yakalamasına izin verir. Kemikli köprü defektin kenarına yakınsa, bu oryantasyon aynı zamanda dokudan alınan ilk daha kalın bölümler sırasında ilgilenilen bölgeyi kaçırma olasılığını da ortadan kaldıracaktır. Kriyo kalıbı, kriyo gömme ortamı katılaşana kadar kuru buz üzerine yerleştirin ve numuneyi sabitleyin. Kriyokalıbı kuru buz üzerinde tutarken ortamla doldurmaya devam edin. Numuneyi sabitledikten sonra, kriyokalıbı tamamen donana kadar kuru buzla soğutulmuş 2-metil-bütan içine daldırın. Dondurma sonrası, fazla 2-metil-bütanı çıkarın, kriyokalıpları selofan içine sarın ve -20 °C veya -80 °C’de saklayın.NOT: Kriyo gömülü bir ortamda 1-2 aydan daha uzun süreli saklama için, kurumayı önlemek için -80 °C önerilir. Bant destekli kriyoseksiyon ve bölümlerin cam slaytlara yapıştırılması daha önce açıklanmıştır23. 7. Sıralı görüntüleme, boyama ve yeniden görüntüleme Daha önce tarif edildiği gibi aynı doku kesiti içinde birden fazla biyolojik sinyalin tespit edilmesini ve kolokalizasyonunu kolaylaştırmak için sıralı bir görüntüleme, boyama ve yeniden görüntüleme prosedürü uygulayın23. Özellikle üç renkli kollajen raportör farelerden alınan büyüme plakası bölümleri için aşağıdaki adımlar önerilir. Bu sıralı yaklaşım, hem moleküler sinyallerin hem de yapısal detayların kapsamlı bir şekilde görselleştirilmesini sağlar.Başlangıçta, ilk görüntüleme turunda üç kollajen için endojen floresan sinyalleri yakalayın. Mineralize doku23 için kalsein mavisi boyama ve görüntü uygulayın, ardından tartarat dirençli asit fosfataz (TRAP) enzimatik aktivite boyama ve görüntüleme23 uygulayın.NOT: TRAP enzimatik aktivite boyama sonuçları burada gösterilmezken, bu boyama adımı, temsili sonuçlar bölümünde sunulan Safranin O / Fast Green boyama sonuçlarından önce mineralin uzaklaştırılması için gerekli olduğu için gerçekleştirilir. Aşağıda anlatıldığı gibi 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) nükleer boyama yapın ve ardından görüntü oluşturun.Önceden görüntülemeden geçmiş slaytları 1x PBS içeren bir Coplin kavanozuna yerleştirin. Lameller slaytlardan ayrılana kadar su altında bırakın. Ayrıldıktan sonra lamelleri çıkarın ve iyice kurulayın. % 50 gliserol ve 1x PBS karışımı içinde 1: 1.000 oranında DAPI seyreltmesi kullanarak lamellere DAPI karşı boyama solüsyonu uygulayın. Uygulama sonrası görüntüleme işlemine devam edin. Doku mimarisini ve ardından görüntüyü vurgulamak için Safranin O / Fast Green boyasının uygulanmasıyla sonlandırın.NOT: Bunu, kromojenik görüntüleri floresan sinyallerle ilişkilendirmek için son adım olarak gerçekleştirin.Weigert’in Demir Hematoksilen çözeltilerini hazırlayın. 1 g hematoksilini 100 mL% 95 etanol içinde çözerek Çözelti A’yı ve 4 mL% 29 Ferrik klorür çözeltisi, 95 mL deiyonize su ve 1 mL konsantre HCl’yi birleştirerek Çözelti B’yi hazırlayın. Weigert’in yaklaşık 4 hafta boyunca stabil olan çalışan hematoksilen çözeltisini oluşturmak için Çözelti A ve B’nin eşit parçalarını karıştırın. Nemlendirmek için slaytları 2 x 2 dakika deiyonize suya batırın. Weigert’in çalışan hematoksilen solüsyonunu 5 dakika boyunca uygulayın. Slaytları musluk suyunda 5 dakika, ardından kısa bir süre deiyonize suda 1 dakika yıkayın. % 0.2 Fast Green solüsyonu (100 mL deiyonize suda 0.2 g Fast Green FCF (100 mL deiyonize su) ile 2 dakika boyunca boyayın. % 1 asetik asit içinde 1 dakika boyunca kısaca durulayın. % 0.1 Safranin O çözeltisi (100 mL deiyonize su içinde 0.1 g Safranin O) ile 1 dakika boyunca boyayın. Görsel olarak dengeli bir renk elde edene kadar yaklaşık 5 dakika deiyonize suda durulayın. Slaytları deiyonize suya% 30 gliserol içinde monte edin (PBS’den kaçının) ve dokudan renk yayılımını önlemek için hemen görüntülemeye devam edin. Büyüme plakasının dinlenme bölgesi hücrelerini vurgulamak için görüntüyü bir Cy5 filtresi ile iletin: ET640/30x (EX), ET690/50 m (EM).