Driekleurig transgeen muizenmodel voor het bestuderen van groeischijfletsel

Het onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de instelling. Alle dierprocedures werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het University of Connecticut Health Center voordat met het werk werd begonnen. Een schets van het protocol is beschreven in het schema van figuur 1 . Figuur 1: Overzicht van het protocol voor beschadiging van de groeischijf bij driekleurige collageenreportermuizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 1. Muizenfokken en voorbereiding op een operatie Fok driekleurige transgene collageenreportermuizen die Col1a1-GFPTpz, Col2a1-CFP en Col10a1-mCherry 16,17,18,19,20,21 tot expressie brengen volgens standaard fokprocedures om pups voor chirurgie te verkrijgen die 2 weken oud zijn (± 1 dag). Verifieer de expressie van het drievoudige transgen door een fragment van de staartpunt te genotyperen onder een fluorescentiemicroscoop. Gebruik alleen de muizen die positief zijn voor alle drie de kleuren om het voordeel van het reportersysteem te maximaliseren tijdens de daaropvolgende histologische analyse.OPMERKING: Deze leeftijd van 2 weken oud (± 1 dag) is gekozen omdat hun botgroeischijven zich in een vergelijkbaar ontwikkelingsstadium bevinden als de menselijke adolescent22. Dit protocol is van toepassing op muizen van beide geslachten. Identificeer op de dag van de operatie of een dag ervoor elke muis die voor de operatie wordt gebruikt op unieke wijze met behulp van een oorpunch na het desinfecteren van het oor en de oorpunch met alcoholantiseptische pads, weeg elke muis en noteer de waarde. Scheer de hele rechter achterpoot van de heup tot de voet met een elektrische tondeuse terwijl de muis onder invloed is van isofluraan anesthesie. Om anesthesie bij muizen te induceren, gebruikt u een mengsel van isofluraan (2-3%) en 100% zuurstof, toegediend met een stroomsnelheid van 1 l/min in een inductiekamer van 1-2 l. Verwijder de muis en controleer of de anesthesiediepte voldoende is met een teenknijp waardoor de muis niet mag bewegen.OPMERKING: Deze diepte van de anesthesie duurt lang genoeg om het scheren uit te voeren zonder dat een anesthesieneuskegel nodig is. Gebruik röntgenbeeldvorming met een vermogensinstelling van 26 kV (800 mA) om scheenbeenbeelden vast te leggen bij levende muizen onder door isofluraan geïnduceerde anesthesie om de initiële lengte van de ledematen vast te leggen.Voordat u de muizen in de röntgenkast plaatst, induceert u een diepe staat van anesthesie met behulp van een mengsel van isofluraan (2-3%) en 100% zuurstof, toegediend met een stroomsnelheid van 1 l/min in een inductiekamer van 1-2 l. Plaats drie verdoofde muizen tegelijk parallel op hun buik in de röntgenkast op een plankhoogte waarmee één beeld kan worden verkregen dat alle drie de muizen omvat. Spreid de poten zodat de scheenbeenderen niet onder de muis worden verborgen. Voor een betere meetnauwkeurigheid plaatst u tijdens de beeldvorming een radiopake weegschaal in de buurt van de muis (Figuur 2A). Breng de voorbereide muizen terug naar hun huisvestingskooi met de moedermuis om volgende chirurgische ingrepen af te wachten. 2. Voorbereiding van chirurgische benodigdheden en steriel werkgebied Steriliseer de volgende items: 10-20 gaasjes, wattenstaafjes met wattenstaafjes, tandboren (diameter 0.5 mm), tandhandstukken, Graefe-pincetten, gebogen hemostatische muggentangen, gebogen fijne scharen, naaldhouders, parodontale sondes en tandcleoïde schijfvormige snijders. Verzamel extra noodzakelijke steriele benodigdheden: een injecteerbare suspensie van buprenorfine, naalden van 20 G, spuiten van 1 ml, handdoekgordijnen, 5-0 ongeverfd, gevlochten, gecoat, vicrylhechtingen, povidonjodium, fosfaatgebufferde zoutoplossing, antiseptische pads voor alcohol, #15 scalpels, chirurgische handschoenen, sox voor omgevingsbarrièrebuis, oogsmeermiddel, 70% ethanolspray. Zet een glaskralensterilisator aan voor extra sterilisatie van items tijdens de operatie en het elektrische verwarmingskussen onder een schone muizenkooi met gesteriliseerd beddengoed. Reinig en steriliseer de fluorescentie-stereomicroscooptafel, aangrenzende oppervlakken en de standaard van het chirurgisch instrument met 70% ethanol. Bedek deze gebieden, die de chirurgische werkruimte zullen worden, met steriele handdoekgordijnen. Monteer het elektronische high-speed tandheelkundig boorsysteem. Sluit het elektronische voetpedaal aan op de bedieningseenheid en bedek het snoer van het handstuk met een gedesinfecteerde oppervlaktebarrièrebuis. Bevestig de steriele ronde tandboor van 0,5 mm. Zet de controller aan en stel deze in op een aandrijfverhouding van 1:1 en een maximum van 30.000 tpm. Zet de flexibele isofluraanmachineslang vast met tape die eindigt met de neuskegel bedekt met een gedesinfecteerde oppervlaktebarrièrebuis sox op de fluorescentie-stereomicroscooptafel. Schakel de fluorescentie-stereomicroscoop en hulpapparatuur in en open de beeldacquisitiesoftware. Figuur 2: Belangrijkste stappen van de procedure voor letsel aan de trilineage fluorescerende reporter muizen groeischijfletsel. (A) Het meten van de scheenbeenlengte door middel van faxitron röntgenbeeldvorming met behulp van een radiopake liniaal die naast de muizen in de röntgenkast is geplaatst. (B) Juiste positie van een verdoofde muis voor chirurgie onder een fluorescentie-stereomicroscoop. Proximaal scheenbeen aangegeven door een zwarte pijl. (C) Een voorbeeld van een incisie die is gemaakt om toegang te krijgen tot de groeischijf. (D) Fluorescentie-stereomicroscopie die de hypertrofische zone van de groeischijf verlicht (witte pijl). De aangrenzende proliferatieve zone wordt aangegeven met een gele pijl. (E) Heldere lichtverlichting van de chirurg die de tandboor van 0,5 mm tegen de groeischijf plaatst. (F) Nauwkeurige plaatsing van de tandboor wordt geleid door fluorescentie-stereomicroscopie in de hypertrofische zone. (G) Een voorbeeld van een Salter-Harris Type II-achtig groeischijfdefect (witte pijl). Schaal balken = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 3. Procedure voor beschadiging van de proximale groeischijf van het scheenbeen Verdoof de muis in de isofluraan-anesthesiekamer en stel de isofluraanconcentratie in op 2-3% en de zuurstofstroomsnelheid op 1 l/min. Wacht op de inductie van een diepe anesthesietoestand, geverifieerd door een teenknijptest en de observatie van ademhalingspatronen. Dien de helft van de voorgeschreven dosis buprenorfine subcutaan toe onmiddellijk na verwijdering van de muis uit de kamer. De dosering van buprenorfine is volgens het goedgekeurde dierprotocol. Breng oculair glijmiddel aan om de ogen van de muis te beschermen tegen uitdroging tijdens de operatie en breng de muis in rugligging over naar de neuskegel van de isofluraanmachine op de stereomicroscooptafel (Figuur 2B). Stel de anesthesiestroom door de neuskegel in op 2% en de zuurstofstroomsnelheid op 1 l/min. Desinfecteer de rechter achterpoot, het bekkengebied, het voorste aspect van de linker achterpoot en de staart achtereenvolgens met povidonjodium gevolgd door 70% ethanol. Controleer een aanhoudende stabiele diepte van anesthesie door middel van een extra teenknijptest en observatie van ademhalingspatronen voordat de operatie begint. Gebruik onder fel licht een #15 scalpel om een incisie in de huid te maken net onder het kniegewricht met een initiële lengte van ongeveer 5 mm, om het proximale uiteinde van het rechter scheenbeen te onthullen (Figuur 2C). Gebruik indien nodig een schaar om de snede te verlengen. Houd het linker contralaterale scheenbeen ongedeerd, zodat het dient als een interne niet-gewonde controle. Voer een verticale stompe dissectie uit door de bovenliggende spier bij het proximale scheenbeen met behulp van de achterkant van de #15 scalpel, waarbij het zachte weefsel wordt verwijderd voor een duidelijke blootstelling van de groeischijf. Schakel de lichten in de operatiekamer uit en selecteer het juiste fluorescentiekanaal om het gewenste gebied van de groeischijf te verlichten. Filtersets die nodig zijn om elk van de fluorescerende collageen af te beelden, zijn Col 2 Cyaan: ET436/20x (excitatie), ET480/40 m (emissie), Col 10 mCherry: ET577/20x (excitatie), ET640/40 m (emissie), Col 1 Topaz: ET500/20x (excitatie), ET535/30 m (emissie). Plaats de muis om de proximale tibiale groeischijf te observeren (Figuur 2D). Pas de huidopening iets meer proximaal en vervolgens distaal aan om ervoor te zorgen dat de tibiale groeischijf in zicht is en niet de dijbeengroeischijf. Creëer een Salter-Harris Type II-achtige laesie terwijl u door het microscoopoculair kijkt door de 0,5 mm tandboorboor evenwijdig aan de tibiale as in het midden van de hypertrofische groeischijfzone te plaatsen, met behulp van een laterale benadering (Figuur 2E,F). Om reproduceerbaar een defect te maken dat een Salter-Harris Type II-laesie nabootst, houdt u de ledemaat evenwijdig aan het werkoppervlak, zodat de toegangsroute van de boor niet in de epifyse kantelt. Oefen druk uit op het boorpedaal om de rotatie van de boor te starten en druk de boor voorzichtig in de groeischijf en stop voordat het defect dieper gaat dan de diameter van de boor (Figuur 2G).OPMERKING: Een tweede paar handen dat helpt bij het stabiliseren van de muisledemaat is nuttig. Spoel de plaats van de laesie met een druppel steriele PBS om vuil te verwijderen. Bevestig de diepte van het defect op 0,5 mm met behulp van een parodontale sonde. 4. Procedures na een blessure en sluiting Voor karakterisering van het defect zonder tijd, oogst u de gewonde achterpoot en de controleledemaat voordat het weefsel wordt gesloten. Volg het oogsten van het weefsel en de voorbereiding op de daaropvolgende microcomputertomografie (microCT) en cryo-histologiebeeldvorming in rubriek 6.OPMERKING: Voor experimenten waarbij een therapeutische stof in het groeischijfdefect wordt geïmplanteerd, kan het defect zelf alleen een stuk biomateriaal bevatten dat ongeveer bolvormig is en een diameter van 0,5 mm of 0,082mm3 (0,082 μL) in volume heeft. Gebruik een pincet onder microscopische visualisatie om het biomateriaal in te brengen of injecteer een vloeibaar therapeutisch middel in het defect in de groeischijf. Gebruik een grotere hoeveelheid biomateriaal of geïnjecteerde stof als de onderzoeksopzet niet vereist dat het therapeutisch middel beperkt blijft tot alleen het defect. Lijn de huidranden voorzichtig opnieuw uit en zorg ervoor dat het geïmplanteerde materiaal, indien aanwezig, stevig op de defecte plaats blijft. Gebruik onderbroken hechttechnieken met 5-0 polyglycolzuurhechtingen om de huidincisie effectief af te dichten. Reinig de gebieden buiten het operatiegebied grondig van povidonjodiumresten met behulp van wattenstaafjes met steriel water, zorg ervoor dat contact met de wond en de nabijgelegen gebieden wordt vermeden. Haal de muis van de isofluraanneuskegel op de microscooptafel naar een herstelkooi en plaats deze zijdelings op vers beddengoed over een verwarmingskussen. Observeer de ademhalingsfrequentie van de muis nauwkeurig gedurende ongeveer 5 minuten en dien de resterende dosis buprenorfine voor analgesie toe, net op het moment dat de effecten van de isofluraananesthesie afnemen, wat wordt aangegeven door een toename van de ademhalingsfrequentie, maar vóór het begin van de mobiliteit. Houd de muis in een geïsoleerde herstelkooi totdat hij volledige ambulante capaciteiten vertoont, en herenig hem daarna met zijn moeder en broers en zussen. Voer dagelijkse inspecties uit gedurende de eerste 48 uur na de operatie, gevolgd door wekelijkse beoordelingen tot aan het punt van euthanasie. Concentreer u op tekenen van infectie, voortbewegingsefficiëntie, toegankelijkheid tot voedsel en de integriteit van hechtingen. Spenen van de muizen op de standaardtijd (d.w.z. 3 weken oud). 5. Lengtemetingen van ledematen Op basis van de tijdstippen bepaald door de experimentele hypothese en het ontwerp, verdooft u de muizen met isofluraan en voert u röntgenbeeldvorming uit van de volledige lengte van zowel de gewonde als de niet-gewonde scheenbeenderen, zoals weergegeven in figuur 2A en beschreven in rubriek 1.4. Geschikte oriëntatiepunten voor het uitvoeren van consistente ledemaatlengtemetingen zijn onder meer de bovenkant van de scheenbeenepifyse en het distale uiteinde van het scheenbeen bij het tibiotalaire gewricht, zoals weergegeven in figuur 3.OPMERKING: Beeldvorming wordt gebruikt om verschillen in ledemaatlengte en ledemaatlengte als gevolg van het letsel te beoordelen, evenals de ontwikkeling van de benige brug in de groeischijfweefsels met specifieke postoperatieve tussenpozen. 6. Weefseldissectie, fixatie, microCT-beeldvorming en inbedding Euthanaseer de muis via CO2 -verstikking, bij voorkeur met behulp van een geautomatiseerd CO2 -inductiesysteem met een bevestiging van de dood door een alternatieve methode zoals cervicale dislocatie. Isoleer beide intacte achterpoten en verwijder huid en spieren uit het bot- en kniekapselgebied ter voorbereiding op histologische en microCT-analyse.Voordat u de achterpoten in het fixeermiddel plaatst, snijdt u de knieschijf voorzichtig weg door deze af te knippen met een micro-ontleedschaar om de fixerende penetratie in de knieholte te vergemakkelijken. Gebruik een insulinespuit van 29 G om de koude 10% gebufferde formaline grondig te verdelen in alle delen van de knieholte. Ernstige het diafysaire gebied van het dijbeen en het scheenbeen om de fixatieve toegang tot de mergruimte te verbeteren. Houd het gewrichtsweefsel gedurende 24-36 uur bij 4 °C in een volledig gestrekte positie in het fixeermiddel door het met gaas aan een dunne plug vast te binden.LET OP: Formaline is giftig en moet worden gehanteerd in een zuurkast terwijl u de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen draagt. Na 24-48 uur formalinefixatie bij 4 °C, voert u röntgenmicroCT met hoge resolutie uit van contralaterale en gewonde monsters door middel van microCT-beeldvorming na het overbrengen van monsters naar PBS, voor beoordeling van de ontwikkeling van de benige brug. Gebruik een voxelgrootte van 6,0 μm, sampletijden van 330.000 ms en energie-instellingen van 55.000 V met een intensiteit van 145 μA. Na microCT-beeldvorming en nog eens 24 uur formalinefixatie bij 4 °C, spoelt u de monsters gedurende 3 x 5 minuten in 1X PBS en dompelt u de monsters vervolgens onder in 10% sucrose in 1X PBS gedurende 1 uur, 20% sucrose in 1X PBS gedurende 1 uur en 30% sucrose in 1X PBS gedurende een nacht. Gebruik een insulinespuit van 29 G gevuld met sucroseoplossing om ervoor te zorgen dat de sucroseoplossing in alle knieholten doordringt. Breng over naar een vriezer van -80 °C als deze niet wordt ingebed na de nachtelijke onderdompeling van sucrose om ervoor te zorgen dat de GFP-reporter en de enzymatische activiteit van het weefsel behouden blijven. Verwijder eventueel achtergebleven spierweefsel uit het gewrichtsgebied voordat u het inbedt. Breng het monster ‘s nachts in evenwicht met een cryo-inbeddingsmedium, waardoor het medium gemakkelijker in de knieholte kan doordringen. Bekijk de microCT-beelden om te bepalen waar het defect en de benige brug zich bevinden voordat ze worden ingebed. Breng een dunne laag van het cryo-inbeddingsmedium aan in een cryomal en plaats het ontlede en nog verbonden scheenbeen/dijbeen/gewricht zodanig dat het interessegebied 90° naar het oppervlak van het inbeddingsmedium wijst.OPMERKING: Deze oriëntatie stelt de doorsnede in staat om het zijaanzicht van het zijdelings gecreëerde defect vast te leggen. Als de benige brug zich aan de rand van het defect bevindt, voorkomt deze oriëntatie ook de mogelijkheid dat het interessegebied wordt gemist tijdens de eerste dikkere secties die door het weefsel worden genomen. Plaats de cryomal op droogijs totdat het cryo-inbeddingsmedium stolt en het monster vastzet. Blijf de cryomold vullen met het medium terwijl je het op droogijs houdt. Nadat u het monster hebt vastgezet, dompelt u de cryomal onder in 2-methylbutaan gekoeld met droogijs tot deze volledig bevroren is. Verwijder na het invriezen overtollig 2-methylbutaan, wikkel de cryomallen in cellofaan en bewaar ze bij -20 °C of -80 °C.OPMERKING: Voor langdurige opslag langer dan 1-2 maanden in een cryo-inbeddingsmedium wordt -80 °C aanbevolen om uitdroging te voorkomen. Tape-geassisteerde cryosecties en hechting van de secties aan de glasplaatjes zijn eerder beschreven23. 7. Sequentiële beeldvorming, kleuring en opnieuw beeldvorming Implementeer een sequentiële procedure van beeldvorming, kleuring en herbeelding om de detectie en colokalisatie van meerdere biologische signalen binnen hetzelfde weefselgedeelte te vergemakkelijken, zoals eerder beschreven23. Specifiek voor de groeischijfsecties van de driekleurige collageenreportermuizen worden de volgende stappen aanbevolen. Deze geordende aanpak zorgt voor een uitgebreide visualisatie van zowel moleculaire signalen als structurele details.In eerste instantie vangt u endogene fluorescerende signalen op voor de drie collagenen in de eerste beeldvormingsronde. Breng calceïne blauwe kleuring en beeld aan voor gemineraliseerd weefsel23, gevolgd door de tartraatresistente zure fosfatase (TRAP) enzymatische activiteitskleuring en beeldvorming23.OPMERKING: Hoewel de kleuringsresultaten van de enzymatische activiteit van TRAP hier niet worden weergegeven, wordt deze kleuringsstap uitgevoerd omdat deze essentieel is voor de verwijdering van mineraal vóór de Safranin O/Fast Green-kleuringsresultaten die worden gepresenteerd in de sectie met representatieve resultaten. Voer 4’,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) nucleaire kleuring uit zoals hieronder beschreven en maak vervolgens beeld.Plaats objectglaasjes die eerder zijn afgebeeld in een Coplin-pot met 1x PBS. Laat ze ondergedompeld totdat de dekglaasjes loskomen van de dia’s. Eenmaal losgemaakt, verwijdert u de dekglaasjes en droogt u ze grondig. Breng DAPI-tegenkleuringsoplossing aan op de dekglaasjes, met behulp van een verdunning van 1:1.000 DAPI in een mengsel van 50% glycerol en 1x PBS. Ga verder met het beeldvormingsproces na het aanbrengen. Sluit af met het aanbrengen van Safranin O/Fast Green-beits om de weefselarchitectuur en vervolgens het beeld te accentueren.OPMERKING: Voer dit uit als de laatste stap om chromogene beelden te correleren met fluorescerende signalen.Bereid Weigert’s Iron Hematoxyline-oplossingen voor. Bereid oplossing A voor door 1 g hematoxyline op te lossen in 100 ml 95% ethanol en oplossing B door 4 ml 29% ijzerchloride-oplossing, 95 ml gedeïoniseerd water en 1 ml geconcentreerd HCl te combineren. Meng gelijke delen oplossing A en B om de werkende hematoxyline-oplossing van Weigert te maken, stabiel gedurende ongeveer 4 weken. Dompel de dia’s 2 x 2 minuten onder in gedeïoniseerd water om te hydrateren. Breng de werkende hematoxyline-oplossing van Weigert aan gedurende 5 minuten. Was de glaasjes 5 minuten in kraanwater en daarna 1 minuut kort in gedeïoniseerd water. Vlek met 0,2% Fast Green-oplossing (0,2 g Fast Green FCF in 100 ml gedeïoniseerd water) gedurende 2 minuten. Spoel kort af in 1% azijnzuur gedurende 1 min. Kleuring met 0,1% Safranin O-oplossing (0,1 g Safranin O in 100 ml gedeïoniseerd water) gedurende 1 minuut. Spoel af in gedeïoniseerd water tot een visueel uitgebalanceerde kleur, ongeveer 5 min. Monteer objectglaasjes in 30% glycerol in gedeïoniseerd water (vermijd PBS) en ga onmiddellijk verder met beeldvorming om kleurdiffusie uit het weefsel te voorkomen. Om de cellen van de rustzone van de groeischijf te accentueren, voert u het beeld uit met een Cy5-filter: ET640/30x (EX), ET690/50 m (EM).