Modelo Murino Transgênico Tricolor para Estudo de Lesão em Placa de Crescimento

A pesquisa foi realizada de acordo com as diretrizes institucionais. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Centro de Saúde da Universidade de Connecticut (IACUC) antes de iniciar o trabalho. Um esboço do protocolo é descrito no esquema da Figura 1 . Figura 1: Esboço do protocolo de lesão da placa de crescimento em camundongos repórteres de colágeno tricolor. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 1. Criação de camundongos e preparação para cirurgia Crie camundongos repórteres de colágeno transgênico tricolor que expressem Col1a1-GFPTpz, Col2a1-CFP e Col10a1-mCherry 16,17,18,19,20,21 de acordo com os procedimentos de reprodução padrão para obter filhotes para cirurgia com 2 semanas de idade (± 1 dia). Verifique a expressão do transgene triplo genotipando um fragmento da ponta da cauda sob um microscópio de fluorescência. Use apenas os camundongos positivos para as três cores para maximizar o benefício do sistema repórter durante a análise histológica subsequente.NOTA: Esta idade de 2 semanas (± 1 dia) é selecionada porque suas placas de crescimento ósseo estão em um estágio de desenvolvimento semelhante ao do adolescente humano22. Este protocolo se aplica a ambos os sexos de camundongos. No dia da cirurgia ou um dia antes, identifique exclusivamente cada camundongo usado para cirurgia usando um punção de orelha após desinfetar a orelha e o punção de orelha com almofadas anti-sépticas de álcool, pesar cada camundongo e registrar o valor. Raspe todo o membro posterior direito, do quadril ao pé, com um cortador elétrico enquanto o camundongo está sob o efeito da anestesia com isoflurano. Para induzir a anestesia em camundongos, use uma mistura de isoflurano (2-3%) e oxigênio a 100%, administrado a uma taxa de fluxo de 1 L / min dentro de uma câmara de indução de 1-2 L. Remova o mouse e confirme se a profundidade da anestesia é suficiente com uma pitada do dedo do pé que não deve fazer com que o mouse se mova.NOTA: Esta profundidade de anestesia durará o suficiente para realizar o barbear sem a necessidade de um cone nasal de anestesia. Empregue imagens de raios-X com uma configuração de potência de 26 kV (800 mA) para capturar imagens tibiais em camundongos vivos sob anestesia induzida por isoflurano para registrar o comprimento inicial do membro.Antes de colocar os camundongos no gabinete de raios-X, induza um estado profundo de anestesia usando uma mistura de isoflurano (2-3%) e oxigênio a 100%, administrado a uma taxa de fluxo de 1 L / min dentro de uma câmara de indução de 1-2 L. Coloque três camundongos anestesiados de cada vez em paralelo de bruços no armário de raios-X a uma altura de prateleira que permita a obtenção de uma imagem que inclua os três camundongos. Abra as pernas para que os ossos tibiais não fiquem obscurecidos sob o mouse. Para maior precisão de medição, posicione uma escala radiopaca perto do mouse durante a imagem (Figura 2A). Retorne os camundongos preparados para sua gaiola de alojamento com a mãe para aguardar os procedimentos cirúrgicos subsequentes. 2. Preparação de material cirúrgico e área de trabalho estéril Esterilize os seguintes itens: 10-20 compressas de gaze, cotonetes aplicadores com ponta de algodão, brocas dentárias (0,5 mm de diâmetro), peças de mão odontológicas, pinças Graefe, pinças hemostáticas curvas de mosquito, tesouras finas curvas, porta-agulhas, sondas periodontais e escultores discóides cleóides dentários. Colete suprimentos estéreis adicionais necessários: uma suspensão injetável de buprenorfina, agulhas de 20 G, seringas de 1 mL, cortinas de toalha, 5-0 não tingidas, trançadas, revestidas, suturas de vicryl, iodopovidona, solução salina tamponada com fosfato, almofadas anti-sépticas com álcool, bisturis # 15, luvas cirúrgicas, sox de tubo de barreira de superfície ambiental, lubrificante para os olhos, spray de etanol a 70%. Ligue um esterilizador de esferas de vidro para esterilização adicional de itens durante a cirurgia e a almofada de aquecimento elétrico sob uma gaiola de rato limpa com roupa de cama esterilizada. Limpe e esterilize a platina do estereomicroscópio de fluorescência, as superfícies adjacentes e o suporte do instrumento cirúrgico usando etanol a 70%. Cubra essas áreas que se tornarão o espaço de trabalho cirúrgico com cortinas de toalha estéreis. Monte o sistema eletrônico de perfuração odontológica de alta velocidade. Conecte o pedal eletrônico à unidade de controle e cubra o cabo da peça de mão com um tubo de barreira de superfície desinfetado sox. Prenda a broca dentária redonda estéril de 0.5 mm. Ligue o controlador e ajuste-o para uma relação de acionamento de 1:1 e um máximo de 30,000 rpm. Prenda, com fita adesiva, a mangueira flexível da máquina de isoflurano que termina com o cone do nariz coberto com um tubo de barreira de superfície desinfetado sox no estágio de estereomicroscópio de fluorescência. Ligue o estereomicroscópio de fluorescência e o equipamento auxiliar e abra o software de aquisição de imagem. Figura 2: Principais etapas do procedimento de lesão da placa de crescimento murino do repórter fluorescente de trilinhagem. (A) Medição do comprimento tibial por imagem de raios-X de faxitron usando uma régua radiopaca colocada ao lado dos camundongos no gabinete de raios-X. (B) Posição adequada de um camundongo anestesiado para cirurgia sob um estereomicroscópio de fluorescência. Tíbia proximal indicada por uma seta preta. (C) Um exemplo de uma incisão feita para acessar a placa de crescimento. (D) Microscopia estereoscópica de fluorescência iluminando a zona hipertrófica da placa de crescimento (seta branca). A zona proliferativa adjacente é indicada por uma seta amarela. (E) Iluminação de luz brilhante do cirurgião colocando a broca dentária de 0,5 mm contra a placa de crescimento. (F) A colocação precisa da broca dentária é guiada por microscopia estereoscópica de fluorescência na zona hipertrófica. (G) Um exemplo de um defeito da placa de crescimento semelhante ao Tipo II de Salter-Harris (seta branca). Barras de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 3. Procedimento de lesão da placa de crescimento da tíbia proximal Anestesiar o camundongo na câmara de anestesia com isoflurano, ajustando a concentração de isoflurano para 2-3% e a taxa de fluxo de oxigênio para 1 L/min. Aguarde a indução de um estado anestésico profundo, verificado por um teste de pinça do dedo do pé e a observação dos padrões respiratórios. Administre metade da dose prescrita de buprenorfina por via subcutânea imediatamente após a remoção do rato da câmara. A dosagem de buprenorfina é de acordo com o protocolo animal aprovado. Aplique lubrificante ocular para proteger os olhos do camundongo de secar durante a cirurgia e transfira o camundongo em decúbito dorsal para o cone do nariz da máquina de isoflurano no estágio do estereomicroscópio (Figura 2B). Ajuste o fluxo de anestesia através do cone do nariz para 2% e a taxa de fluxo de oxigênio para 1 L/min. Desinfete o membro posterior direito, a região pélvica, a face anterior do membro posterior esquerdo e a cauda sequencialmente com iodopovidona seguido de etanol a 70%. Verifique uma profundidade estável contínua da anestesia por meio de um teste adicional de pinça do dedo do pé e observação dos padrões respiratórios antes do início da cirurgia. Sob iluminação de luz forte, empregue um bisturi # 15 para criar uma incisão na pele logo abaixo da articulação do joelho com um comprimento inicial de aproximadamente 5 mm, para revelar a extremidade proximal da tíbia direita (Figura 2C). Use uma tesoura para estender o corte, se necessário. Mantenha a tíbia contralateral esquerda sem lesões para que ela sirva como um controle interno sem lesões. Realize uma dissecção romba vertical através do músculo sobrejacente na tíbia proximal usando a parte de trás do bisturi # 15, removendo o tecido mole para uma exposição clara da placa de crescimento. Desligue as luzes da sala de cirurgia e selecione o canal de fluorescência correto para iluminar a região desejada da placa de crescimento. Os conjuntos de filtros necessários para obter imagens de cada um dos colágenos fluorescentes são Col 2 Cyan: ET436 / 20x (excitação), ET480 / 40 m (emissão), Col 10 mCherry: ET577 / 20x (excitação), ET640 / 40 m (emissão), Col 1 Topaz: ET500 / 20x (excitação), ET535 / 30 m (emissão). Posicione o mouse para observar a placa de crescimento tibial proximal (Figura 2D). Ajuste a abertura da pele um pouco mais proximal e, em seguida, distal para garantir que a placa de crescimento tibial esteja à vista e não a placa de crescimento do fêmur. Crie uma lesão semelhante a Salter-Harris Tipo II enquanto olha pela ocular do microscópio, posicionando a broca odontológica de 0,5 mm paralela ao eixo tibial no meio da zona da placa de crescimento hipertrófica, empregando uma abordagem lateral (Figura 2E, F). Para fazer um defeito de forma reprodutível que imite uma lesão de Salter-Harris Tipo II, mantenha o membro paralelo à superfície de trabalho para que a via de entrada da broca não se incline para a epífise. Aplique pressão no pedal da broca para iniciar a rotação da broca e pressione suavemente a broca na placa de crescimento, parando antes que o defeito seja mais profundo do que o diâmetro da broca (Figura 2G).NOTA: Um segundo par de mãos ajudando a estabilizar o membro do mouse é útil. Irrigue o local da lesão com uma gota de PBS estéril para remover quaisquer detritos. Confirme a profundidade do defeito em 0,5 mm usando uma sonda periodontal. 4. Procedimentos pós-lesão e encerramento Para caracterização de defeito de tempo zero, colha o membro posterior lesionado e o membro de controle antes do fechamento do tecido. Siga a coleta e preparação do tecido para subsequente tomografia computadorizada (microCT) e imagem crio-histológica na seção 6.NOTA: Para experimentos envolvendo a implantação de uma substância terapêutica no defeito da placa de crescimento, o defeito em si só pode acomodar um pedaço de biomaterial que seja aproximadamente esférico e 0,5 mm de diâmetro ou 0,082 mm3 (0,082 μL) de volume. Utilize uma pinça sob visualização microscópica para inserir o biomaterial ou injetar um líquido terapêutico no defeito dentro da placa de crescimento. Use um volume maior de biomaterial ou substância injetada se o desenho do estudo não exigir que a terapêutica seja limitada apenas ao defeito. Realinhe cuidadosamente as bordas da pele, garantindo que o material implantado, se houver, permaneça seguro dentro do local do defeito. Empregue técnicas de sutura interrompida com suturas de ácido poliglicólico 5-0 para selar a incisão da pele de forma eficaz. Limpe bem as áreas além da região cirúrgica do resíduo de iodopovidona usando cotonetes com água estéril, tomando cuidado para evitar o contato com a ferida e as áreas circundantes. Remova o mouse do cone do nariz de isoflurano no microscópio stage para uma gaiola de recuperação, posicionando-o lateralmente sobre uma cama fresca sobre uma almofada de aquecimento. Observe atentamente a frequência respiratória do camundongo por aproximadamente 5 min, administrando a dose restante de buprenorfina para analgesia, assim como os efeitos da anestesia com isoflurano diminuem, indicados por um aumento na frequência respiratória, mas antes do início da mobilidade. Mantenha o camundongo em uma gaiola de recuperação isolada até que ele demonstre todas as capacidades ambulatórias, depois disso, reunindo-o com sua mãe e irmãos. Realize inspeções diárias para as 48 horas iniciais após a operação, seguidas de avaliações semanais até o ponto da eutanásia. Concentre-se nos sinais de infecção, eficácia da locomoção, acessibilidade aos alimentos e integridade das suturas. Desmame os camundongos no horário padrão (ou seja, 3 semanas de idade). 5. Medidas do comprimento dos membros Com base nos pontos de tempo determinados pela hipótese e desenho experimental, anestesiar os camundongos com isoflurano e realizar imagens de raios-X de todo o comprimento das tíbias lesionadas e não lesionadas, conforme mostrado na Figura 2A e descrito na seção 1.4. Pontos de referência adequados para fazer medições consistentes do comprimento do membro incluem o topo da epífise tibial e a extremidade distal da tíbia na articulação tibiotalar, conforme mostrado na Figura 3.NOTA: A imagem é usada para avaliar o comprimento do membro e as discrepâncias de comprimento do membro devido à lesão, bem como o desenvolvimento da ponte óssea dentro dos tecidos da placa de crescimento em intervalos pós-operatórios específicos. 6. Dissecção de tecido, fixação, imagem microCT e incorporação Eutanasiar o camundongo por meio de asfixia por CO2 , de preferência usando um sistema automatizado de indução de CO2 com confirmação de morte por um método alternativo, como luxação cervical. Isole os membros posteriores intactos e remova a pele e o músculo da área capsular do osso e do joelho em preparação para análise histológica e microCT.Antes de colocar os membros posteriores no fixador, excise a patela cuidadosamente, cortando-a com uma tesoura de microdissecação para facilitar a penetração do fixador na cavidade do joelho. Empregue uma seringa de insulina de 29 G para distribuir completamente a formalina tamponada a 10% fria em todas as áreas da cavidade do joelho. Grave a região diafisária do fêmur e da tíbia para melhorar o acesso do fixador ao espaço medular. Manter o tecido articular numa posição totalmente estendida dentro do fixador durante 24-36 h a 4 °C, amarrando-o com gaze a uma bucha fina.CUIDADO: A formalina é tóxica e deve ser manuseada em um exaustor usando equipamento de proteção individual adequado. Após 24-48 h de fixação em formalina a 4 °C, realizar microCT de raios-X de alta resolução de amostras contralaterais e lesionadas por microCT após a transferência de amostras para PBS, para avaliação do desenvolvimento da ponte óssea. Use um tamanho de voxel de 6,0 μm, tempos de amostragem de 330.000 ms e configurações de energia de 55.000 V com uma intensidade de 145 μA. Após a microTC e mais 24 h de fixação de formalina a 4 °C, enxágue as amostras em 1X PBS por 3 x 5 min e, em seguida, mergulhe as amostras em sacarose a 10% em PBS 1X por 1 h, sacarose a 20% em PBS 1X por 1 h e sacarose a 30% em PBS 1X durante a noite. Use uma seringa de insulina de 29 G cheia de solução de sacarose para garantir que a solução de sacarose permeie todas as regiões da cavidade do joelho. Transfira para um freezer a -80 ° C se não for incorporado após a imersão noturna com sacarose para garantir a retenção do repórter de GFP e da atividade enzimática do tecido. Remova qualquer tecido muscular residual da região articular antes de incorporar. Equilibre a amostra com um meio de crio-incorporação durante a noite, facilitando a penetração do meio na cavidade do joelho. Visualize as imagens de microCT para determinar onde o defeito e a ponte óssea estão localizados antes da incorporação. Aplicar uma fina camada do meio de crio-incorporação num criomoldor e colocar a tíbia/fémur/articulação dissecada e ainda ligada de modo a que a região de interesse fique virada a 90° em relação à superfície do meio de incorporação.NOTA: Esta orientação permite que o corte capture a vista lateral do defeito criado lateralmente. Se a ponte óssea estiver perto da borda do defeito, essa orientação também evitará a possibilidade de perder a região de interesse durante as primeiras seções mais espessas feitas através do tecido. Posicione o criomold em gelo seco até que o meio crio-incorporador solidifique, prendendo a amostra. Continue a encher o criomold com o meio, mantendo-o em gelo seco. Depois de fixar a amostra, mergulhe o criomold em 2-metil-butano refrigerado com gelo seco até que esteja totalmente congelado. Após o congelamento, remova o excesso de 2-metil-butano, envolva os criomoldes em celofane e armazene a -20 °C ou -80 °C.NOTA: Para armazenamento prolongado por mais de 1-2 meses em meio crio-incorporador, recomenda-se -80 ° C para evitar o ressecamento. O crioseccionamento assistido por fita adesiva e a adesão dos cortes às lâminas de vidro são descritos anteriormente23. 7. Imagem sequencial, coloração e recriação de imagens Implemente um procedimento sequencial de imagem, coloração e reimagem para facilitar a detecção e colocalização de múltiplos sinais biológicos dentro da mesma seção de tecido, conforme descrito anteriormente23. Especificamente para as seções da placa de crescimento dos camundongos repórteres de colágeno tricolor, as etapas a seguir são recomendadas. Essa abordagem ordenada garante uma visualização abrangente de sinais moleculares e detalhes estruturais.Inicialmente, capture sinais fluorescentes endógenos para os três colágenos na primeira rodada de imagens. Aplique coloração e imagem de azul de calceína para tecido mineralizado23, seguido pela coloração e imagem da atividade enzimática da fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP)23.NOTA: Embora os resultados da coloração da atividade enzimática TRAP não sejam exibidos aqui, esta etapa de coloração é realizada, pois é essencial para a remoção do mineral antes dos resultados da coloração Safranin O/Fast Green apresentados na seção de resultados representativos. Realize a coloração nuclear de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) conforme descrito abaixo e, em seguida, a imagem.Coloque as lâminas que passaram por imagens anteriores em um frasco Coplin contendo 1x PBS. Deixe-os submersos até que as lamínulas se soltem das lâminas. Depois de destacadas, remova e seque bem as lamínulas. Aplique a solução de contracoloração DAPI nas lamínulas, utilizando uma diluição de 1:1.000 de DAPI em uma mistura de 50% de glicerol e 1x PBS. Prossiga com o processo de imagem após a aplicação. Conclua com a aplicação da coloração Safranin O/Fast Green para acentuar a arquitetura do tecido e, em seguida, a imagem.NOTA: Execute isso como a etapa final para correlacionar imagens cromogênicas com sinais fluorescentes.Prepare as soluções de hematoxilina de ferro da Weigert. Prepare a Solução A dissolvendo 1 g de hematoxilina em 100 mL de etanol a 95% e a Solução B combinando 4 mL de solução de cloreto férrico a 29%, 95 mL de água deionizada e 1 mL de HCl concentrado. Misture partes iguais da Solução A e B para criar a solução de hematoxilina de trabalho de Weigert, estável por aproximadamente 4 semanas. Mergulhe as lâminas em água deionizada por 2 x 2 min para hidratar. Aplique a solução de hematoxilina de trabalho da Weigert por 5 min. Lave as lâminas em água da torneira por 5 min e, em seguida, brevemente em água deionizada por 1 min. Manchar com solução Fast Green a 0,2% (0,2 g de Fast Green FCF em 100 mL de água deionizada) por 2 min. Enxágue brevemente em ácido acético a 1% por 1 min. Manchar com solução de Safranina O a 0,1% (0,1 g de Safranina O em 100 mL de água deionizada) por 1 min. Enxágue em água deionizada até obter uma cor visualmente equilibrada, aproximadamente 5 min. Monte as lâminas em glicerol a 30% em água deionizada (evite PBS) e prossiga para a imagem imediatamente para evitar a difusão da cor do tecido. Para acentuar as células da zona de repouso da placa de crescimento, conduza a imagem com um filtro Cy5: ET640/30x (EX), ET690/50 m (EM).