成長板損傷を研究するためのトリコロールトランスジェニックマウスモデル

この研究は、機関のガイドラインに準拠して実施されました。すべての動物用手順は、作業を開始する前に、コネチカット大学ヘルスセンターの施設内動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。プロトコルの概要を 図1 の回路図に示します。 図1:トリコロールコラーゲンレポーターマウスにおける成長板損傷プロトコルの概要。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 1. マウスの育種と手術の準備 Col1a1-GFPTpz、Col2a1-CFP、およびCol10a1-mCherry 16,17,18,19,20,21を標準的な繁殖手順に従って発現するトリコロールトランスジェニックコラーゲンレポーターマウスを繁殖させ、生後2週間(±1日)の手術用子犬を取得します。蛍光顕微鏡で尾端フラグメントのジェノタイピングを行うことにより、トリプル導入遺伝子の発現を確認します。3色すべてに陽性のマウスのみを使用して、その後の組織学的解析時にレポーターシステムの利点を最大化します。注:この生後2週間齢(±1日)は、骨成長板が人間の青年期と同様の発達段階にあるため、選択されます22。このプロトコルは、マウスの雌雄両方に適用されます。 手術当日または手術前日に、アルコール消毒パッドで耳とイヤーパンチを消毒した後、イヤーパンチを使用して手術に使用した各マウスを一意に識別し、各マウスの体重を量り、値を記録します。 マウスがイソフルラン麻酔の効果下にある間に、電動クリッパーで股関節から足までの右後肢全体を剃ります。マウスに麻酔を誘発するには、イソフルラン(2〜3%)と100%酸素の混合物を使用し、1〜2Lの誘導チャンバー内で1L / minの流量で投与します。マウスを取り外し、マウスが動かないようにつま先をつまんで、麻酔の深さが十分であることを確認します。注:この麻酔の深さは、麻酔鼻円錐を必要とせずにシェービングを行うのに十分な長さ続きます。 26 kV(800 mA)の電力設定でX線イメージングを採用し、イソフルラン誘発麻酔下で生きたマウスの脛骨画像をキャプチャし、初期肢の長さを記録します。マウスをX線キャビネットに入れる前に、イソフルラン(2〜3%)と100%酸素の混合物を使用して、1〜2Lの誘導チャンバー内で1L /分の流量で投与して、深い麻酔状態を誘発します。 麻酔をかけたマウス3匹を、X線キャビネットの腹に一度に平行に置き、3匹のマウスすべてを含む1枚の画像を取得できる棚の高さに置きます。脛骨がマウスの下に隠れないように、脚を広げます。測定精度を向上させるには、イメージング中にマウスの近くにX線不透過性スケールを配置します(図2A)。 準備したマウスを母マウスと一緒にハウジングケージに戻し、その後の外科的処置を待ちます。 2.手術用品と滅菌作業エリアの準備 次のアイテムを滅菌します:10〜20ガーゼパッド、綿先端アプリケーター綿棒、歯科用バー(直径0.5 mm)、歯科用ハンドピース、Graefe鉗子、湾曲した蚊止血鉗子、湾曲した細いはさみ、ニードルホルダー、歯周プローブ、および歯科用cleoid discoid carver。 ブプレノルフィンの注射可能な懸濁液、20 G針、1 mLシリンジ、タオルカーテン、5-0未染色、編組、コーティング、ビクリル縫合糸、ポビドンヨード、リン酸緩衝生理食塩水、アルコール消毒パッド、#15メス、手術用手袋、環境表面バリアチューブソックス、眼用潤滑剤、70%エタノールスプレー。手術中のアイテムの追加滅菌のためにガラスビーズ滅菌器の電源を入れ、滅菌された寝具を備えた清潔なマウスケージの下の電気加熱パッドの電源を入れます。 蛍光実体顕微鏡ステージ、隣接する表面、および手術器具スタンドを70%エタノールを使用して洗浄および滅菌します。手術用ワークスペースとなるこれらの領域を滅菌タオルカーテンで覆います。 電子高速歯科用ドリルシステムを組み立てます。電子フットコントローラーをコントロールユニットに接続し、ハンドピースコードを消毒された表面バリアチューブソックスで覆います。滅菌済みの0.5mm丸型デンタルバーを取り付けます。コントローラーの電源を入れ、駆動比を1:1、最大30,000rpmに設定します。 蛍光実体顕微鏡ステージ上の消毒された表面バリアチューブソックスで覆われたノーズコーンで終端する柔軟なイソフルランマシンホースをテープで固定します。 蛍光実体顕微鏡と補助装置の電源を入れ、画像取得ソフトウェアを開きます。 図2:三系統蛍光レポーターマウス成長板損傷手順の主要なステップ(A)X線キャビネット内のマウスの横に配置された放射線不透過性定規を使用したファキシトロンX線イメージングによる脛骨の長さの測定。(B)蛍光実体顕微鏡下での手術のための麻酔マウスの適切な位置。近位脛骨は黒い矢印で示されています。(C)成長板にアクセスするために行われた切開の例。(D)成長板の肥大領域を照らす蛍光実体顕微鏡(白矢印)。隣接する増殖ゾーンは黄色の矢印で示されます。(E)0.5mmのデンタルバーを成長プレートに当てる外科医の明るい光の照明。(F) デンタルバーの正確な配置は、蛍光立体顕微鏡によって肥厚領域にガイドされます。(G)Salter-Harris II型様成長板欠損の一例(白矢印)。スケールバー = 1 mm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 3.近位脛骨成長板損傷の手順 イソフルラン麻酔室でマウスに麻酔をかけ、イソフルラン濃度を2〜3%に、酸素流量を1L / minに調整します。つま先をつま先つまむテストと呼吸パターンの観察によって確認された深い麻酔状態の誘導を待ちます。 マウスをチャンバーから取り出した直後に、処方された用量のブプレノルフィンの半分を皮下投与します。.ブプレノルフィンの投与量は、承認された動物プロトコルに従っています。 手術中にマウスの眼が乾燥するのを防ぐために眼用潤滑剤を塗布し、仰臥位のマウスを実体顕微鏡ステージ上のイソフルランマシンノーズコーンに移します(図2B)。ノーズコーンを通る麻酔の流れを2%に、酸素の流量を1L / minに調整します。 右後肢、骨盤領域、左後肢の前面、尾をポビドンヨードと70%エタノールで順次消毒します。 手術開始前に、追加のつま先つま先つまみテストと呼吸パターンの観察を通じて、麻酔の深さが安定し続けていることを確認します。 明るい光の照明の下で、#15メスを使用して、膝関節のすぐ下の皮膚に初期の長さ約5 mmの切開を作成し、右脛骨の近位端を明らかにします(図2C)。必要に応じてハサミを使ってカットを伸ばします。左の反対側の脛骨を損傷しないようにして、内部の無傷のコントロールとして機能するようにします。 #15メスの裏側を使用して、近位脛骨の上にある筋肉を通して垂直鈍的解剖を行い、軟部組織を除去して成長板をはっきりと露出させます。 手術室の照明を消し、成長プレートの目的の領域を照らすための正しい蛍光チャネルを選択します。各蛍光コラーゲンのイメージングに必要なフィルターセットは、Col 2 Cyan:ET436/20x(励起)、ET480/40 m(発光)、Col 10 mCherry:ET577/20x(励起)、ET640/40 m(発光)、Col 1 Topaz:ET500/20x(励起)、ET535/30 m(発光)です。マウスを配置して、近位脛骨成長板を観察します(図2D)。皮膚の開口部を少し近位に調整し、次に遠位に調整して、脛骨成長板が大腿骨成長板ではなく視界に入ることを確認します。 顕微鏡の接眼レンズを覗きながら、0.5 mmの歯科用ドリルバーを肥厚性成長板ゾーンの中央の脛骨軸に平行に配置し、横方向のアプローチを使用して、Salter-Harris II型のような病変を作成します(図2E、F)。Salter-Harris II型病変を模倣した欠損を再現性よく作るには、バーエントリ経路が骨端に角度をつけないように、四肢を作業面と平行に保ちます。ドリルペダルに圧力をかけてバーの回転を開始し、欠陥がバーの直径よりも深くなる前に停止して、バーを成長プレートにゆっくりと押し込みます(図2G)。注:マウスの手足を安定させるのを助ける2番目の手が役立ちます。 病変部位を滅菌PBSの滴で洗浄し、破片を取り除きます。 歯周プローブを使用して、0.5mmの欠陥の深さを確認します。 4. 怪我後の手続きと閉鎖 タイムゼロ欠陥の特性評価のためには、組織閉鎖前に負傷した後肢と制御肢を採取します。セクション6では、組織採取とその後のマイクロコンピューター断層撮影(microCT)および凍結組織学イメージングの準備に従ってください。注:成長板欠損部に治療物質を移植する実験では、欠損自体は、ほぼ球形で直径0.5mmまたは体積0.082mm3(0.082μL)の生体材料片のみに対応できます。 顕微鏡で可視化された鉗子を使用して、生体材料を挿入したり、成長プレート内の欠陥に液体治療薬を注入したりします。研究デザインが治療を欠陥のみに制限する必要がない場合は、大量の生体材料または注入された物質を使用してください。 皮膚の縁を慎重に再調整し、埋め込まれた材料がある場合は、欠陥部位内にしっかりと留まるようにします。 5-0ポリグリコール酸縫合糸による中断縫合技術を採用し、皮膚の切開部を効果的にシールします。 滅菌水を入れた綿棒を使用して、ポビドンヨード残留物の手術領域を超えた領域を徹底的に洗浄し、創傷や密接な周辺領域との接触を避けるように注意を払います。. マウスを顕微鏡ステージ上のイソフルランノーズコーンからリカバリーケージに移し、加熱パッドの上の新鮮な寝具の上に横方向に配置します。 マウスの呼吸数を約5分間注意深く観察し、イソフルラン麻酔の効果が減少するのと同じように、鎮痛のための残りのブプレノルフィン用量を投与します。これは、呼吸数の増加によって示されますが、可動性が始まる前に。.マウスを隔離された回復ケージに保持し、完全な歩行能力を発揮するまで、その後、マウスを母親や兄弟と再会させます。 手術後48時間の最初の検査を毎日実施し、その後、安楽死の時点まで毎週評価を行います。感染の兆候、移動の有効性、食物へのアクセスのしやすさ、縫合糸の完全性に焦点を当てます。 標準的な時期(すなわち、生後3週間)でマウスを離乳させる。 5.四肢の長さの測定 実験仮説と設計によって決定された時点に基づいて、マウスにイソフルランを麻酔し、 図 2A で示され、セクション 1.4 で説明されているように、損傷した脛骨と負傷していない脛骨の両方の全長の X 線イメージングを行います。一貫した四肢の長さの測定を行うための適切なランドマークには、 図 3 に示すように、脛骨骨端の上部と脛骨距関節の脛骨の遠位端が含まれます。注: イメージングは、損傷による四肢の長さと四肢の長さの不一致、および特定の術後間隔での成長板組織内の骨橋の発達を評価するために使用されます。 6. 組織解剖、固定、マイクロCTイメージング、埋埋入 CO2窒息によりマウスを安楽死させ、好ましくは、子宮頸部脱臼などの代替方法による死亡確認を伴う自動CO2誘導システムを使用する。 無傷の後肢を分離し、組織学的およびマイクロCT分析の準備として、骨と膝の被膜領域から皮膚と筋肉を切除します。後肢を固定液に入れる前に、膝蓋骨をマイクロ解剖ハサミで切り取り、膝蓋骨を慎重に切除し、膝腔への固定剤の浸透を促進します。29 Gインスリン注射器を使用して、膝腔のすべての領域に冷たい10%緩衝ホルマリンを完全に分配します。大腿骨と脛骨の骨幹領域を重症化して、骨髄腔への固定アクセスを改善します。関節組織を固定剤内で完全に伸ばした位置に保持し、ガーゼで細いダボに結び付けて、4°Cで24〜36時間保持します。注意:ホルマリンは有毒であるため、適切な個人用保護具を着用しながらドラフトで取り扱ってください。 4°Cでホルマリン固定の24-48時間後、骨ブリッジの発達を評価するために、サンプルをPBSに移した後、マイクロCTイメージングにより反対側および負傷したサンプルの高解像度X線マイクロCTを実施します。ボクセルサイズ6.0μm、サンプル時間330,000ms、エネルギー設定55,000V、強度145μAを使用します。 マイクロCTイメージングと4°Cでのホルマリン固定をさらに24時間行った後、サンプルを1X PBSで3×5分間すすぎ、次にサンプルを1X PBSの10%スクロースに1時間、1X PBSに20%スクロースを1時間、1X PBSに30%スクロースを一晩浸します。スクロース溶液で満たされた29Gインスリンシリンジを使用して、スクロース溶液がすべての膝腔領域に浸透するようにします。.一晩ショ糖に浸漬した後に包埋しない場合は、-80°Cの冷凍庫に移し、GFPレポーターと組織酵素活性の保持を確保します。 埋め込む前に、関節領域から残っている筋肉組織をすべて取り除きます。クライオ包埋培地でサンプルを一晩平衡化し、培地が膝腔に浸透するのを促進します。 マイクロCT画像を表示して、埋め込み前に欠損部と骨ブリッジがどこにあるかを判断します。クライオ埋め込み培地の薄層をクライオモールドに塗布し、解剖され、まだ接続されている脛骨/大腿骨/関節を、関心領域が埋め込み培地の表面に対して90°を向くように配置します。注:この向きにより、切片化は横方向に作成された欠陥の側面図をキャプチャできます。骨ブリッジが欠損部の端に近い場合、この向きにより、組織を通過する最初の厚い部分で関心領域が失われる可能性も回避されます。 クライオエンベッド培地が固化するまでクライオモールドをドライアイス上に配置し、試料を固定します。クライオモールドをドライアイスの上に置いたまま、培地を充填し続けます。 試料を固定した後、ドライアイスで冷やした2-メチルブタンにクライオモールドを浸漬し、完全に凍結させます。凍結後、余分な2-メチルブタンを取り除き、クライオモールドをセロハンで包み、-20°Cまたは-80°Cで保存します。注:クライオ包埋培地で1〜2か月を超えて長期間保存する場合は、乾燥を防ぐために-80°Cをお勧めします。テープ支援クライオセクショニングおよび切片のスライドガラスへの接着は、前述した23。 7. シーケンシャルイメージング、染色、再イメージング イメージング、染色、および再イメージングの連続的な手順を実施して、前述の23と同様に、同じ組織切片内の複数の生物学的シグナルの検出および共局在を容易にする。特にトリコロールコラーゲンレポーターマウスの成長プレート切片には、次の手順が推奨されます。この順序付けられたアプローチにより、分子シグナルと構造の詳細の両方を包括的に視覚化できます。最初に、イメージングの最初のラウンドで3つのコラーゲンの内因性蛍光シグナルを捕捉します。 石灰化組織23にカルセインブルー染色と画像を適用し、続いて酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)酵素活性染色とイメージング23を適用します。注:TRAP酵素活性染色の結果はここには表示されませんが、この染色ステップは、代表的な結果セクションに示されているSafranin O/Fast Green染色結果の前にミネラルを除去するために不可欠であるため、実行されます。 以下に説明するように4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)核染色を行い、次に画像化します。以前にイメージングを受けたスライドを、1x PBSを含むCoplinジャーに入れます。カバーガラスがスライドから剥がれるまで、それらを水に浸しておきます。取り外したら、カバースリップを取り外して完全に乾かします。 50%グリセロールと1x PBSの混合物に1:1,000で希釈したDAPIを利用して、DAPI対比染色液をカバーガラスに塗布します。アプリケーション後にイメージングプロセスに進みます。 最後に、Safranin O/Fast Green染色剤を塗布して組織構造を強調し、次に画像化します。注:これを最終ステップとして実行し、発色画像を蛍光シグナルと相関させます。ヴァイゲルトの鉄ヘマトキシリン溶液を調製します。1 gのヘマトキシリンを100 mLの95%エタノールに溶解して溶液Aを調製し、4 mLの29%塩化第二鉄溶液、95 mLの脱イオン水、および1 mLの濃縮HClを組み合わせて溶液Bを調製します。溶液AとBを等量混合して、約4週間安定なWeigertの作業用ヘマトキシリン溶液を作成します。 スライドを脱イオン水に2 x 2分間浸して水和させます。 ヴァイゲルトの作業用ヘマトキシリン溶液を5分間塗布します。 スライドを水道水で5分間洗浄し、次に脱イオン水で1分間短時間洗浄します。 0.2% Fast Green 溶液 (0.2 g の Fast Green FCF を 100 mL の脱イオン水に含ませたもの) で 2 分間染色します。 1%酢酸で1分間短時間すすぎます。 0.1%サフラニンO溶液(100 mLの脱イオン水に0.1 gのサフラニンO)で1分間染色します。 脱イオン水ですすいで、視覚的にバランスの取れた色になるまで、約5分間します。 スライドを脱イオン水に30%グリセロールにセットし(PBSは避けてください)、すぐにイメージングに進み、組織からの色の拡散を防ぎます。成長プレートの静止領域細胞を強調するために、Cy5フィルターで画像を実行します:ET640/30x(EX)、ET690/50m(EM)。